Listeria monocytogenes

Základní charakteristika

Listeria monocytogenes (rod Listeria, čeleď Listeriaceae) je fakultativně anaerobní, nesporotvorná, krátká grampozitivní tyčinka. Buňky jsou 1 – 2 µm dlouhé, vyskytují se jednotlivě nebo ve dvojicích, příležitostně může tvořit i řetízky (v závislosti na růstových podmínkách).

Rod Listeria zahrnuje 6 druhů: L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. welshimeri, L. seeligeri a L. grayi. Z nich pouze L..monocytogenes je patogenní pro člověka i pro zvířata, L. ivanovii je patogenní pouze pro zvířata.

Na krevním agaru vytváří L. monocytogenes zónu striktní ß-hemolýzy (zóna je pouze pod kolonií). L. monocytogenes je pohyblivá při teplotách do 25 °C, nad 30 °C ztrácí bičíky a stává se nepohyblivou. Bičíky jsou umístěny peritrichálně, pro listerie je charakteristický vířivý pohyb.

Všechny listerie produkují enzym katalázu, fermentují glukózu s tvorbou kyseliny, ale bez produkce plynu a hydrolyzují eskulin. L. monocytogenes fermentuje rhamnózu, ale ne xylózu.

L. monocytogenes lze na základě somatických O-antigenů klasifikovat do 13 sérotypů: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4ab a 7. Nejčastěji se na vzniku onemocnění podílí sérotypy 1/2a, 1/2b a 4b, z nichž sérotyp 4b je nejvíce virulentní. Na základě bičíkových H-antigenů lze odlišit do 5 séroskupin (A – E).

Faktory virulence

L. monocytogenes produkuje řadu faktorů virulence. Mezi hlavní faktory podílející se na ulpění k povrchu buněk a následném průniku do jejich nitra patří internaliny (internalin A se uplatňuje při průniku listerií do střevních epitelií a placentárních buněk, internalin B se uplatňuje při invazi do hepatocytů), LAP (Listeria adhezivní protein), Ami (autolyzin amidáza), protein p60, virulenční protein Vip a další adhezivní proteiny.

Další skupinu tvoří faktory uplatňující se při lýze vakuol (fagozomů) – listeriolyzin O (hemolyzin) a fosfolipázy C. Rozlišujeme dva typy fosfolipázy C – fosfatidylinositol specifická fosfolipáza (PI-PLP), která se rozrušuje membránu primárního fagozomu, a fosfatidylcholin specifická fosfolipáza (PC-PLP), která rozrušuje dvojitou membránu vakuoly při šíření listerií z buňky do buňky.

Aktin polymerační protein (ActA) iniciuje polymerizaci aktinu a tím napomáhá pohybu bakterií cytoplazmou buňky.

Další významné vlastnosti

Podobně jako další bakterie, např. S. aureus, mohou listerie po navázání na vhodný povrch vytvořit mnohovrstevný biofilm. Biofilmy představují závažný problém jak ve zdravotnictví, tak v potravinářském průmyslu. Rizikem je především vysoká odolnost biofilmů k antimikrobiálním látkám, čistícím a desinfekčním prostředkům a možnost přenosu genů rezistence mezi buňkami biofilmu.

Patogeneze

L. monocytogenes je intracelulární patogen, onemocnění postihuje zejména osoby se sníženou imunitou. Infekční dávka není dosud jednoznačně určena. Předpokládá se, že u zdravých osob je poměrně vysoká asi 10⁸ buněk, u rizikových skupin je výrazně nižší 10² – 10³ buněk. Také inkubační doba je rozdílná – několik dnů až týdnů, a to v závislosti na infekční dávce, virulenci bakterií a imunitním stavu pacienta. Cesta přenosu je především alimentární, vzácně i kontaktem (např. profesionální expozice při manipulaci se zvířaty).

Vlastní mechanismus patogeneze zahrnuje 2 fáze: intestinální a systémovou. Po konzumaci kontaminovaných potravin, se listerie dostávají do tenkého střeva, které kolonizují a pronikají skrz mukózní bariéru do krevního řečiště a lymfatického systému. Během systémového šíření jsou bakterie pomocí makrofágů či dendritických buněk transportovány do jater, sleziny, lymfatických uzlin, mozku a placenty.

Celulární mechanismus patogeneze zahrnuje 4 hlavní kroky: 1) přilnutí a průnik do buňky, 2) lýza vakuoly (fagozomu), 3) intracelulární růst a 4) šíření do dalších buněk. Kritickou fází infekce je adheze na epiteliální buňky a následné proniknutí listerií do buněk. Po průniku do hostitelské buňky je L. monocytogenes zachycena ve vakuole (fagozomu). Bakterie je však schopna vakuolu rozrušit a proniknout do cytoplazmy. Následně dochází k namnožení bakterií v cytoplazmě a jejich posunu směrem k sousední buňce, do které bakterie pronikají. Po průniku do následující buňky je bakterie uzavřena ve dvoumembránové vakuole, kterou opět lyzuje a celý proces se opakuje.

L. monocytogenes vyvolává 3 formy onemocnění: 1) gastrointestinální forma, 2) systémová listerióza a 3) potraty a neonatální listerióza. U zdravých jedinců může onemocnění probíhat v podobě lehčích chřipkových příznaků.

Gastrointestinální forma postihuje zejména dospělé osoby, inkubační doba obvykle nepřesahuje 24 hodin, ale může být i 10 dní. Účinkem bakterií dojde k narušení absorpce nutrientů v trávicím traktu a ke zvýšení sekrece tekutin. Pro gastroenteritidu je charakteristická horečka, bolesti hlavy, nevolnost, zvracení, abdominální bolesti a vodnatý nekrvavý průjem.

Systémová listerióza je onemocnění postihující zejména děti, starší občany, těhotné ženy a další osoby se sníženou imunitou (pacienti s AIDS, pacienti po chemoterapii, po transplantaci orgánů, diabetici, alkoholici a pacienti s kardiovaskulárním onemocněním). Během krátké doby bakterie kolonizují střevo a pronikají střevní bariérou do krevního řečiště a lymfatického systému. Během 24 hodin se většina bakterií dostává do jater (90 %), sleziny, žlučníku a regionálních mízních uzlin. Po krátké bakteriemii přechází listerie hematoencefalickou bariérou do mozku, kde vyvolávají meningitidu a encefalitidu. U těhotných žen pronikají skrz placentu a infikují plod. Mezi hlavní klinické příznaky patří horečka, bolesti hlavy, malátnost, septikémie, meningitida, encefalitida, ataxie, bakteriemie a abscesy na játrech. Onemocnění může mít fatální průběh.

Těhotné ženy jsou extrémně citlivé k onemocnění L. monocytogenes. Ke komplikacím dochází ve třetím trimestru těhotenství. Při systémovém onemocnění těhotných žen dochází k intrauterinní infekci, listerie pronikají skrz placentární bariéru do plodové vody či přímo do vyvíjejícího se plodu. Dochází k předčasným porodům, spontánním potratům, porodu mrtvého dítěte či k neonatální infekci dítěte.

Rozeznáváme 2 formy neonatální listeriózy. V prvním případě dojde k propuknutí onemocnění velmi rychle během 1,5 dne. K infekci plodu dojde v děloze, mortalita je v tomto případě vysoká. Při pozdní formě, která se rozvíjí po dobu asi 14 dní, dochází k infekci plodu v průběhu porodu z vaginálních cest, příp. i z vnějšího prostředí. Dominantním klinickým příznakem je v tomto případě meningitida. Symptomy dále zahrnují dýchací potíže, pneumonii, zánět spojivek, vyrážku, zvracení, křeče a hypo- či hypertermii.

Epidemiologický význam

Listerióza není příliš časté onemocnění, ale řada případů může končit fatálně. Uvádí se, že mortalita v případě listeriózy je asi 20 – 30 %, u neonatální listeriózy až 36 %. Počet hlášených listerióz se dle databáze Epidat SZÚ v České republice pohyboval mezi lety 2001 – 2010 v rozmezí 12 – 78 nemocných osob za rok. Nejvyšší počet nemocných (78 osob) byl zaznamenán v roce 2006 (epidemie listeriózy v ČR).

První prevencí výskytu listeriózy je dobrá hygienická úroveň v chovech hospodářských zvířat a zkrmování kvalitních krmiv, zejména řádně prokysaných siláží s hodnotou pH  4,0, při které listerie dlouhodobě nepřežívají. V potravinářských podnicích potom dodržování systému HACCP a zamezení sekundární kontaminace potravin. Potraviny určené k přímé spotřebě by měly být dostatečně tepelně ošetřeny, potraviny konzumované bez tepelné úpravy je nutné řádné omytí v tekoucí vodě (např. ovoce a zelenina). Těhotným ženám se doporučuje vyhýbat se rizikovým potravinám.

Výskyt v surovinách a potravinách

L. monocytogenes je ubikvitární mikroorganismus, běžně se nachází v půdě, povrchových vodách, odpadech, na rostlinách, včetně zeleného krmiva (např. nekvalitní siláže). Dále se vyskytuje ve střevním traktu zdravých lidí, hospodářských zvířat, ptáků, ryb a hlodavců.

U skotu se může objevit listeriová mastitida, častější je sekundární kontaminace syrového mléka při dojení. Častá je i postpasterační kontaminace z prostředí potravinářských závodů a výrobního zařízení.

Z potravin kontaminuje L. monocytogenes nejčastěji syrové maso a vařené masné výrobky, syrovou zeleninu, ryby (zejména uzené), syrové mléko a mléčné výrobky (zejména některé druhy sýrů – sýry zrající pod mazem, sýry s plísní na povrchu a sýry s plísní v těstě), lahůdkářské výrobky.

Vliv vnějších a vnitřních faktorů a technologických procesů

Listerie se v přírodě běžně vyskytují, přežívají i v extrémních podmínkách (pH koncentrace soli do 10 %) i za přítomnosti antimikrobiálních látek. Listerie jsou psychrotrofní a rostou v širokém rozmezí teplot 1 – 45 °C, optimální teplota růstu je 30 – 37 °C. Generační doba při teplotě 4 °C je 30 – 40 hodin, při teplotě 8 °C jenom 10 – 13 hodin. Chladírenské teploty jsou pro listerie příznivé, přežívají také mražení.

L. monocytogenes toleruje široké rozmezí pH 4,3 – 9,6 (optimální hodnota pH 7,0). Je schopná růstu v přítomnosti 10 % NaCl a při aktivitě vody do 0,92.

Bakterie mléčného kvašení a bakteriociny inhibují růst L. monocytogenes, na druhou stranu může přežívat proces mléčného kvašení zeleniny. Dále je citlivá k běžným desinfekčním prostředkům. L. monocytogenes nepřežívá sterilační teploty, ale podobně jako další nesporotvorné grampozitivní bakterie je více odolná k vyšším teplotám než bakterie čeledi Enterobacteriaceae. Spolehlivě ji devitalizují vyšší pasterační teploty nad 80 °C (záleží na úrovni předpasterační kontaminace).

Metody stanovení v potravinách

Stanovení Listeria monocytogenes v potravinách se provádí kvalitativně i kvantitativně. V obou případech se ke kultivaci používají selektivní tekuté či pevné půdy obsahující látky inhibující růst doprovodné mikroflóry (např. chlorid litný, akriflavin, polymyxin), dále eskulin, který listerie štěpí na eskuletin, jenž s citrátem železitoamonným tvoří hnědočerný barevný komplex. Z chromogenních médií jsou standardně používány agary ALOA a Rapid`L.mono umožňující odlišení L. monocytogenes od dalších druhů listerií.

Morfologie kolonií L. monocytogenes na ALOA agaru je dána aktivitou enzymu fosfolipázy C – výrazná zóna precipitace, a dále aktivitou enzymu galaktozidázy – modrozelená barva kolonií. Chromogenní médium Rapid`L.mono využívá pro odlišení L. monocytogenes detekci fosfolipázy C – tmavomodrý chromofor a xylózu, na jejíž štěpení reaguje acidobazický indikátor fenolová červeň. Půda Rapid`L.mono je intenzivně červené barvy. L. monocytogenes na ní roste v  modrých koloniích (fosfolipáza C pozitivní, xylóza negativní), L. ivanovii v koloniích modrozelených se žlutou okolní zónou (fosfolipáza C pozitivní, xylóza pozitivní), kolonie L. innocua jsou bílé a kolonie L. welshimeri a L. seeligeri bílé někdy se žlutým okolím.

Podle ČSN EN ISO 11290-1 (1999) zahrnuje průkaz L. monocytogenes čtyři po sobě jdoucí stupně. Zkoušený vzorek se inokuluje do tekuté selektivní půdy pro primární pomnožení – poloviční bujón podle Frasera (½FB médium). Získaná kultura se přeočkuje do tekuté selektivní půdy pro sekundární pomnožení – bujón podle Frasera (FB médium). Z primárního i sekundárního pomnožení se provádí vyočkování na dvě pevné selektivní půdy – agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho (ALOA agar) a kteroukoli jinou selektivní půdu (např. PALCAM agar ). Následně se provede konfirmace vybraných suspektních kolonií.

Při stanovení počtu L. monocytogenes podle ČSN EN ISO 11290-2 (1999) se nejprve provede resuscitace vzorku v tekutém médiu a poté jeho inokulace na ALOA agar. Následně se provede konfirmace vybraných suspektních kolonií.

Alternativní způsoby detekce listerií v potravinách využívají zejména imunochemických metod – metoda ELFA, metoda ELISA nebo imunochromatografická metoda.

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci

Charakteristické kolonie jsou konfirmovány biochemicky, pro odlišení jednotlivých druhů listerií se využívá fermentace některých uhlohydrátů – rhamnózy, xylózy a manitolu.

Pro odlišení hemolytických druhů listerií se běžně používá CAMP test (Christie, Atkinson, Munch-Peterson test). L. monocytogenes (příp. i L. seeligeri) je ve formě proužků nanesena na krevní agar, a to kolmo k nanesené linii Staphylococcus aureus. Po inkubaci se v místě křížení obou kultur vytvoří jasná zóna hemolýzy připomínající hrot šípu. Podobnou reakci vytváří i L. ivanovii vůči kultuře Rhodococcus equi.

V rámci typizace izolátů L. monocytogenes se provádí sérotypizace aglutinační reakcí za použití specifických protilátek proti somatickým O-antigenům. Další možností je fágová typizace.

Polymerázovou řetězovou reakci (PCR) lze využít k detekci L. monocytogenes přímo v potravinách, při identifikaci izolátů listerií, k identifikaci vybraných sérotypů či k detekci genů kódujících produkci jednotlivých faktorů virulence (např. listeriolyzin O, internaliny) či genů rezistence k antimikrobiálním látkám.

Při genotypové charakterizaci izolátů L. monocytogenes lze mimo různých modifikací PCR (např. nested-PCR, multiplex PCR, real-time PCR, RAPD) využít i metodu PFGE či microarrays.