Molekulární biologie

PCR (polymerázová řetězová reakce)

PCR (polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce) je metoda molekulární biologie používaná k množení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro.

Princip

Princip amplifikace DNA touto metodou in vitro je podobný replikaci DNA in vivo. Kopie úseku DNA jsou syntetizovány podle templátu (jednořetězcová DNA) pomocí enzymu DNA-polymerázy na principu komplementarity bazí. Vysokou teplotou dojde k denaturaci dvouřetězcové DNA a získaná jednořetězcová vlákna slouží jako templát. V další fázi je zapotřebí dvou primerů (čti prajmrů), chemicky syntetizovaných krátkých oligonukleotidů, které se připojují ke komplementárním úsekům řetězců DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. Pomocí primerů je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován.

Složení reakční směsi

• templátová DNA, která byla izolovaná ze vzorku (z různých mikroorganizmů, bioptických vzorků, stěrů, z buněk z tkáňových kultur, z tělních tekutin)
• synteticky připravené primery (každý komplementární k jednomu řetězci DNA)
• směs nukleotidů dNTP (deoxyribonukleosidtrifosfáty)
• termostabilní enzym DNA polymeráza (např. Taq polymeráza získaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus žijící v horkých pramenech)

(dNTP a DNA polymeráza jsou součástí tzv. master mixu)

Průběh PCR

Reakční směs pro PCR se napipetuje do malé PCR zkumavky, která se vloží do termocycleru/termocykleru (čti termosajkleru) ve kterém probíhají teplotní cykly.

Každý cyklus má 3 fáze (denaturace, annealing a extension) s odlišnými teplotami. Tento cyklus se opakuje obvykle 25-35x. Do reakce se navíc zařazuje počáteční denaturace a závěrečná polymerační reakce.

Počáteční denaturace DNA (separace řetězců DNA) (94 °C, 2-5 min)

1. denaturace – separace (rozvolnění) řetězců DNA vlivem vysoké teploty (94 - 95 °C, 20-45 s)
2. annealing – připojení (nasedání) primerů na vlákno DNA na principu komplementarity dusíkatých bazí (50-60 °C, 30-90s)
3. extension – polymerační reakce, syntéza komplementárního řetězce DNA, kdy DNA polymeráza nasedne na primery a připojuje volné nukleotidy k vláknu DNA na principu komplementarity dusíkatých bazí (72 °C, 45-90s)

Závěrečná polymerační reakce - dosyntetizování řetězců (72 °C, 5 min)

Obr. 1: Průběh PCR: 1 - denatuarace, 2 - annealing, 3 - extension

Výsledný produkt PCR (amplifikovaný úsek DNA) lze analyzovat např. stanovením velikosti produktu gelovou elektroforézou, štěpením restrikčními enzymy a posouzením vznikajících restrikčních fragmentů (RFLP), hybridizací se značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku nebo stanovením sekvence DNA (sekvenování).

Variantou PCR umožňující syntézu cDNA podle RNA templátu je reverzní PCR (RT-PCR) využívající enzymu reverzní transkriptázy.

Výhodou PCR je, že vyžaduje minimální množství DNA (teoreticky stačí 1 molekula DNA). Touto metodou lze získat 2ⁿ kopií DNA, kdy n je počet cyklů. Z jedné molekuly DNA lze tedy například získat po proběhnutí 30ti amplifikačních cyklů víc než 10⁹ kopií.

Využití

PCR slouží k namnožení materiálu pro další biotechnologické metody, jako je:

• sekvenování DNA
• analýza genů
• DNA fingerprinting
• diagnostika infekčních nemocí
• zjišťování genetických nemocí
• identifikace osob

PCR zavedl v roce 1983 Kary Mullis (za objev této metody dostal Nobelovu cenu).
PCR = polymerázová řetězová reakce (polymerázová, protože se používá enzym DNA polymeráza, řetězová reakce, protože množství DNA roste během jednotlivých cyklů řetězovou řadou, tj. 2, 4, 8, 16, 32).

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.