Mikroskopická technika

POTŘEBY K MIKROSKOPOVÁNÍ
Laboratorní sklo: podložní skla (76 × 26 × 1-1,2 mm se zabroušenými okraji nebo bez zábrusu), krycí skla (čtvercového nebo obdélníkového tvaru 18 × 18, 22 × 22, 30 × 40 mm), kádinky, zkumavky, Petriho misky, střičky, odměrné válce, nálevky
Nástroje: kahan, nůžky, skalpel, pinzeta, bakteriologická klička, preparační jehla, kapátko
Přístroje: mikroskop, lupa, vodní lázeň
Chemikálie: kyseliny, hydroxidy a jejich soli, barviva, imerzní olej

PŘÍPRAVA MIKROSKOPU K MIKROSKOPOVÁNÍ znamená umístění mikroskopu tak, aby nosič tubusu byl od pozorovatele odvrácen a volná strana mikroskopického stolku směřovala k němu. Mikroskop musí být snadno v dosahu, aby pozorovatel mohl pohodlně sedět. Nejlépe je psát záznamy vpravo od mikroskopu a vlevo si umístit potřeby pro přípravu preparátů (leváci naopak). Mikroskop se spouští spínačem umístěným v podstavci mikroskopu. Pokud přerušujete mikroskopování pouze na čas, mikroskop nevypínejte (opakovaným zapínáním se zkracuje životnost žárovky). Preparát se vkládá do rohu upínacího zařízení stolku a poté se uchytí svorkou. Při mikroskopování se postupuje od nejméně zvětšujících objektivů po nejvíce zvětšující, tj. 4×, 10×, 40× a 100×.
Při zvětšení 40× a vyšším je vhodné korigovat optické vady očí, protože většina lidí nemá obě oční čočky stejně dioptricky silné. Nejdříve je třeba upravit rozestup okulárů (oční rozestup) a poté se snažit pozorovat obraz oběma očima. Pozorování jen jedním okem vyvolává jeho neúměrnou zátěž a při opakovaném zatěžování zhoršuje vady oka. Rozdíl vede opět k neúměrnému zatěžování jednoho oka. Vadu je možné kompenzovat úpravou dioptrické síly levého okuláru takto: zavřete levé oko a obraz dokonale zaostřete mikrošroubem při pozorování pravým okem v pravém okuláru, zakryjte si pravé oko a pozorujte obraz levým okem v levém okuláru. Pokud není obraz dokonale ostrý, zaostřete objekt pomocí točítka dioptrické korekce na levém okuláru. Poté byste měli oběma očima vidět stejně ostře. Vyhledáním optimální vzdáleností očí od okulárů docílíte při troše cviku splynutí obrazu z obou okulárů a obě oči tak budete zatěžovat rovnoměrně.

ZASTAVENÍ OBJEKTU V ZORNÉM POLI MIKROSKOPU znamená umístění objektu do středu zorného pole a zaostření a osvětlení obrazu objektu v zorném poli. Preparát se pokládá na stolek mikroskopu pod pérovou svorku tak, aby objekt nebo krycí sklo byly umístěny nad otvorem stolku směrem k objektivu (podložním sklem dolů a krycím nahoru). Při zastavování objektu v mikroskopu je třeba se dívat do mikroskopu a současně pomocí křížového vodiče pohybovat preparátem na stolku mikroskopu a pomocí makroposuvu najít správnou volnou pracovní vzdálenost. Jakmile se v mikroskopu objeví objekt, provede se doostření pomocí mikroposuvu. Je třeba si také seřídit osvětlení mikroskopu pomocí regulátoru osvětlení (v podstavci mikroskopu) a zvýšit hloubku ostrosti pomocí irisové clony kondenzoru. Při pozorování málo kontrastních objektů (epitelie, objektivový mikrometr, pylová zrna) je potřeba více zaclonit a zaostřit na správnou optickou rovinu. Při pozorování preparátů je potřeba dát si pozor na tzv. artefakty (termín poprvé použil Sir Julian Huxley), jako jsou např. škrábance, kazy ve skle, bubliny, prach, útvary z želatiny apod., které bývají zaměňovány za pozorované objekty.

Nejčastější chyby (závady) a jejich odstraňování:

Do velkých zásahů a oprav mikroskopu se nepouštějte, výjimkou jsou některé technické závady, které můžete sami odstranit:

Chyba (závada) Příčina Odstranění
mikroskop nesvítí šňůra není v zásuvce nebo není zastrčena "nadoraz" do mikroskopu zastrčit šňůru do zásuvky a do mikroskopu "nadoraz"
makroposuv jde ztuha špatné nastavení tuhosti chodu natočte točítko makroposuvu proti směru hodinových ručiček
mikroskop samovolně sjíždí špatné nastavení tuhosti chodu natočte točítko makroposuvu ve směru hodinových ručiček
neostrý obraz, nejde zaostřit při použití objektivu 40x preparát je krycím sklem dolů položte preparát správně
zalepený objektiv vyčistěte objektiv
obraz je zamlžen znečištěný objektiv (prach, olej) objektiv očistěte od prachu a otřete hadříkem (vatovým tamponem) navlhčeným v alkoholu
znečištěný okulár (při otáčení okulárem se otáčí i nečistota) očistěte okulár od prachu, otisků prstů apod.
nedostatečné osvětlení obrazu kondenzor je příliš nízko posuňte kondenzor a nastavte nejlepší osvětlení
osvětlená jen část obrazu, abnormální zorné pole neúplně otočena revolverová hlavice objektivů při střídání objektivů otočte revolverovou hlavici až po zaklapnutí západky (pořádně "docvaknout" objektiv)
obraz je málo kontrastní velký otvor u clony kondenzoru přivřete irisovou clonu kondenzoru
nedaří se nalézt objekty při malém zvětšení málo kontrastní objekty (epitelie, objektivový mikrometr, ale i pylová zrna) více zaclonit a zaostřit na správnou optickou rovinu
objekt zmizí při přechodu na větší zvětšení 40× a 100× objekt je umístěn na okraji zorného pole vrátit se k menšímu zvětšení, a umístit objekt do středu zorného pole (středit)
vibrace preparátu, vzduchové bubliny moc nebo málo vody optimalizovat množství vody přidávané k preparátu
záměna za artefakty hledání mimo správnou optickou rovinu zaostřit na správnou optickou rovinu
nejde rozlišit objekty tlustý preparát, příliš mnoho materiálu připravit tenkou homogenní vrstvu

Fáze a zásady mikroskopování:

  1. Umístění mikroskopu před sebe, tak aby byl snadno v dosahu, a aby pozorovatel pohodlně seděl (mikroskopem během mikroskopování nepohybovat - při velkých zvětšeních se objekt může ztratit). Kontrola kompletnosti mikroskopu a zapnutí mikroskopu.
  2. Prohlédnutí preparátu nejdříve pouhým okem ke zjištění polohy, velikosti nebo obarvení objektu (na některých preparátech je fixem v kroužku vyznačeno, kde je třeba objekt hledat). Hledat v obarvené části preparátu.
  3. Umístění preparátu na stolek pod pérovou svorku (krycím sklem nahoru) a umístění objektu (pokud je viditelný pouhým okem) do dráhy světelného paprsku (ověřit z dálky při otevřené irisové cloně).
  4. Seřízení rozestupu okulárů a kontrola nastavení dioptrického doostřování.
  5. Levá ruka ovládá makrošroub a mikrošroub k vyhledání správné optické roviny a zaostření, pravá ruka ovládá křížový posun k vyhledávání objektů. K systematickému prohlížení preparátu slouží meandrovitý způsob.
  6. Pozorování objektu nejdříve pod málo zvětšujícími objektivy (4× a 10×), středně zvětšujícími objektivy (40×) a nakonec pod imerzním objektivem (100×). Objektivy 40× a 100× nejsou na vyhledávání objektu, ale na detailní prohlédnutí objektu nalezeného při menších zvětšeních. Při použití objektivů 4× a 10× ostřit makrošroubem, při použití objektivů 40× a 100× ostřit mikrošroubem.
  7. Při každém zvětšení je potřeba upravit množství procházejícího světla pomocí regulátoru napětí v podstavci mikroskopu a zvýšením hloubky ostrosti pomocí irisové clony. Při malém zvětšení co nejvíce zaclonit (uzavřít irisovou clonu) a přitom přidat světlo na zdroji (ne přidušené oranžové). Při větších zvětšeních je třeba postupně přidávat osvětlení otvíráním irisové clony.
  8. Před každým použitím více zvětšujícího objektivu je třeba objekt umístit do středu zorného pole (tzv. středění objektu).
  9. Záznam o pozorování (protokol – kresba, popis, závěr).
  10. Před vytáhnutím preparátu z mikroskopu je dobré vrátit se k nejméně zvětšujícímu objektivu - preparát se díky většímu prostoru bezpečněji vyndá. Očištění preparátu a objektivu od imerze alkoholem, vypnutí mikroskopu a jeho přikrytí igelitovým krytem.

MĚŘENÍ VÝŠKY (TLOUŠŤKY) OBJEKTU se provádí pomocí mikrometrického měřítka vyrytého na objímce mikroposuvu. Obvod tohoto šroubu je rozdělen na 50 dílků po 2,5 µm. Při měření se postupuje tak, že se zaznamená hodnota dílku na měřítku při zaostření detailu objektu v horní optické rovině a poté se odečte hodnota dílku na měřítku při zaostření detailu objektu v dolní optické rovině. Počet dílků (rozdíl mezi odečtenými hodnotami) násobený 2,5 µm představuje skutečnou výšku (tloušťku) objektu v µm.

Výška (tloušťka) objektu v µm = 2,5 x počet dílků otočených mezi horní a spodní optickou rovinou.

Kontrolní otázky – mikroskopická technika

  • Z jakých částí se skládá světelný mikroskop?
  • Co se děje s objektem při zobrazování ve světelném mikroskopu, jaký obraz vzniká?
  • Jak se mění volná pracovní vzdálenost, velikost zobrazené plochy a detaily v zorném poli v závislosti na použitém zvětšení?
  • Co znamená středění objektu a proč se dělá?
  • Jak je třeba upravit clonu v závislosti na použitém zvětšení?
  • Jak se provádí měření tloušťky (výšky) mikroskopického objektu?

ÚKOLY - mikroskopická technika (viz úkoly)

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.

 
Logo OPVK

OPVK

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Palackého tř. 1/3

tel.: +420 54156 1111
IČ 62157124