Bacillus cereus

Základní charakteristika

Bacillus cereus (rod Bacillus, čeleď Bacillaceae) je fakultativně anaerobní, sporotvorná, grampozitivní tyčinka, pohyblivá díky přítomnosti peritrichálních bičíků. Velikost vegetativních buněk je v průměru 1 x 3 – 7 µm, buňky se vyskytují ojediněle nebo v řetízcích.

Vegetativní buňky B. cereus tvoří vždy jednu endosporu, která má oválný až cylindrický tvar, je umístěna centrálně či subterminálně a nezvětšuje průměr buňky (tzv. nezduřuje buňku). Sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku, protože energii pro sporulaci získává bakterie oxidací zásobních lipidů z cytoplazmy (poly-ß-hydroxymáselná kyselina).

B. cereus nezkvašuje manitol, je VP-test pozitivní, utilizuje citráty, ale ne močovinu, většina kmenů redukuje nitráty. Na krevním agaru vytváří různě širokou zónu ß-hemolýzy .

Rod Bacillus obsahuje 51 druhů, které jsou na základě morfologie spor a sporangia rozděleny do tří skupin. B. cereus patří do skupiny 1A (tzv. B. cereus group), a to společně s B. anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides a B. weihenstephanensis. Tato skupina je poměrně nutričně nenáročná, buňky mají průměr více než 1 μm a elipsoidní spory nezpůsobují zduření sporangia.

Faktory virulence

B. cereus je producentem celé řady toxinů a enzymů. Jedná se zejména o emetický toxin, diarhogenní enterotoxiny, hemolysiny (typ I, II a III), 2 typy fosfolipázy C, sfingomyelinázu a enzymy s proteolytickou, lipolytickou a amylolytickou aktivitou (ty se uplatňují při kažení potravin).

Emetický toxin (cereulid) je termostabilní polypeptid (121 °C po 90 minut), aktivní v širokém rozmezí pH (pH 2 – 11) a odolný vůči působení proteolytických enzymů. Maximální produkce cereulidu je pozorována během stacionární fáze růstu bakterií v potravině a může být vázána na sporulaci.

B. cereus produkuje 3 základní diarhogenní enterotoxiny: hemolysin BL, nehemolytický enterotoxin a cytotoxin K. Nově byly izolovány i enterotoxin BceT a enterotoxin FM. Diarhogenní enterotoxiny jsou termolabilní proteiny citlivé k proteolytickým enzymům. Jsou produkovány během pozdní exponenciální a na začátku stacionární fáze růstu při množení bakterií ve střevě. Významným faktorem virulence je hemolyzin BL, který se skládá ze tří komponent (B, L₁ a L₂), má hemolytickou, cytotoxickou a dermonekrotickou aktivitu a zvyšuje permeabilitu cév. Cytotoxin K je zodpovědný za nekrotickou enteritidu doprovázenou krvavým průjmem.

Další významné vlastnosti

B. cereus je také významným původcem kažení potravin, zejména mléčných výrobků (např. sladké srážení mléka, hořknutí smetany). Vzhledem k produkci termorezistentních spor se podílí na kažení pasterovaných, příp. sterilizovaných výrobků.

Kažení potravin je umožněno díky produkci celé řady enzymů, schopných degradovat jejich základní složky. Jedná se o proteázy (degradace kaseinu a želatinu), amylázu (hydrolýza škrobu), lecitinázu, sfingomyelinázu a fosfolipázu (degradace fosfolipidů) a lipázy (degradace triacylglyceridů).

B. cereus je přirozeně rezistentní k penicilinům díky produkci ß-laktamázy.

Patogeneze

Konzumace potravin kontaminovaných bakteriemi B. cereus může vyústit ve 2 různé formy alimentárního onemocnění – emetický a diarhogenní syndrom.

Emetický syndrom je alimentární intoxikace a vzniká po konzumaci potravin obsahujících vyprodukovaný emetický toxin. Toxická dávka je přibližně 30 μg na kg živé váhy. Toxin cereulid se váže na receptory nervus vagus v žaludku a indukuje zvracení. V některých případech může také způsobit selhání jater jako následek degenerace hepatocytů. Typické symptomy – nauzea a zvracení, se objevují 1 – 6 hodin po konzumaci kontaminované potraviny a nepřetrvávají obvykle déle než 24 hodin, poté onemocnění spontánně odezní. Průběh onemocnění připomíná stafylokokovou enterotoxikózu.

Diarhogenní enterotoxiny jsou produkovány po kolonizaci bakterií v tenkém střevě. Pokud dojde k produkci enterotoxinů v potravině, obvykle jsou inaktivovány nízkým pH a účinkem proteolytických enzymů v žaludku. Předpokládá se, že enterotoxiny vyvolávají průjem v důsledku tvorby transmembránových pórů v membráně enterocytů, což má za následek ztráty Na⁺, Cl^- a H₂O z epiteliálních buněk. Diarhogenní syndrom se objevuje 8 – 16 hodin po konzumaci kontaminované potraviny. Mezi klinické příznaky patří vodnatý průjem, nauzea a abdominální bolesti, příležitostně se může objevit i zvracení. Potíže přetrvávají 12 – 24 hodin, potom spontánně odezní.

Epidemiologický význam

Spory B. cereus se běžně vyskytují v prostředí a často kontaminují potraviny. Bakterie je také běžnou součástí střevní mikroflory člověka. K alimentárním otravám dochází po pomnožení bakterií v potravinách na množství přibližně 10⁷ buněk v gramu (v případě dětí 10⁵ v gramu). Vzhledem k tomu, že spory B. cereus obvykle přežívají teploty používané při výrobě potravin a přípravě pokrmů, je důležitým preventivním opatřením skladování potravin a hotových pokrmů při teplotách, které neumožňují vyklíčení spor (pod 4 °C nebo nad 60 °C).

Výskyt v surovinách a potravinách

B. cereus je ubikvitární mikroorganismus, jeho spory se běžně nachází v půdě, prachu, příp. i ve vodě. Často kontaminuje mléko, maso a potraviny rostlinného původu.

Emetický syndrom bývá obvykle spojen s konzumací těstovin a rýže, dále masa (hovězí, vepřové), mléčných pudinků a kojenecké výživy. Kmeny zodpovědné za diarhogenní syndrom jsou obvykle izolovány z masa a masných výrobků, ryb, omáček, zeleniny (např. kukuřice), vařených brambor a mléčných výrobků.

Vliv vnějších a vnitřních faktorů a technologických procesů

Růstové optimum pro vegetativní buňky B. cereus je 30 – 35 °C, maximum 48 – 55 °C, při teplotách pod 10 °C se obvykle nemnoží. Výjimku tvoří psychrotrofní kmeny, které se množí i při teplotě 4 °C, tyto kmeny jsou často izolovány z mléčných výrobků. Vegetativní buňky jsou běžně devitalizovány pasterací či podobných tepelným ošetřením. B. cereus roste v rozmezí pH 4,3 – 9,3. Minimální aktivita vody pro růst a množení je 0,92 – 0,95. B. cereus je schopen růstu v prostředí s maximálním přídavkem 7 % NaCl.

Ke tvorbě spor – sporulaci, dochází obvykle na konci exponenciální a začátkem stacionární fáze růstu, za příznivých podmínek trvá 16 – 24 hodin. Ke sporulaci nedochází za nízkých teplot. Klíčení spor – germinace, je rychlejší než sporulace a je závislá na teplotě, při optimální teplotě trvá asi 1 hodinu. K aktivaci germinace spor dochází záhřevem na pasterační teploty (72 – 85 °C). Termorezistence spor B. cereus je v porovnání s ostatními druhy rodu Bacillus relativně nízká, u mezofilních kmenů je D₁₀₀ = 0,3 – 10 minut, u psychrotrofních kmenů potom D₉₀ = 2 – 9 minut. UHT ošetření spory B. cereus obvykle spolehlivě ničí.

Emetický toxin je termostabilní, odolává záhřevu 121 °C po dobu 90 minut. Aktivitu si zachovává při pH 2 – 11, je odolný vůči působení proteolytických enzymů (pepsin, trypsin). Diarhogenní enterotoxiny jsou stabilní při pH 4 – 11, jsou termolabilní – účinně jsou inaktivovány teplotou 56 °C po dobu 5 minut. Proteolytické enzymy je štěpí. Většina psychrotrofních kmenů je schopna produkovat toxiny i při teplotě 4 °C, ale až po dlouhé době více než 21 dní).

Metody stanovení v potravinách

Pro stanovení B. cereus se používají živná média obsahující selektivní složky inhibující růst doprovodných mikroorganismů (např. zvýšená koncentrace NaCl, polymyxin B), diagnostickou složkou je obvykle vaječný žloutek (precipitace v důsledku lecitinázové aktivity) a manitol, který B. cereus nefermentuje.

Podle ČSN EN ISO 7932 (2005) je pro izolaci B. cereus z potravin určen Mannitol Yolk Polymyxine B agar (MYP), kde B. cereus roste ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými okraji, růžové barvy (negativní manitol), obklopených růžovou zónou precipitace (lecitinázová aktivita). Touto metodou je stanoven počet tzv. presumptivních Bacillus cereus, tedy předpokládaných příslušníků tohoto druhu. Použitými konfirmačními testy totiž nelze odlišit B. cereus od blízce příbuzných, ale řidčeji se vyskytujících druhů – B. anthracis, B. thuringiensis, B. weihenstephaniensis a B. mycoides.

Další možností je použití půdy Polymyxin Egg Yolk Mannitol Bromthymol agar (PEMBA), kde roste B. cereus v modrých koloniích opět obklopených zónou precipitace (lecitinázová aktivita). Pro izolaci B. cereus lze využít i chromogenní média .

Pro stanovení spor B. cereus je nezbytná tepelná inaktivace vegetativních buněk ve vzorku (80 °C po 10 minut), současně dojde i k aktivaci germinace spor. K vlastní kultivaci lze použít běžné obohacené médium (např. krevní agar).

K detekci přítomnosti diarhogenních enterotoxinů B. cereus lze využít komerčně dostupné kity na bázi imunochemických metod - ELISA metodu detekující NheA podjednotku nehemolytického enterotoxinu (BDE-VIA) nebo reverzní pasivní latexovou aglutinaci detekující L₂ podjednotku hemolyzinu BL (BCET-RPLA).

Pro detekci emetického toxinu se používají metody využívající tkáňové kultury či biologický pokus.

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci

Spolu s typickou morfologií kolonií na selektivně-diagnostických půdách se posuzuje tvorba úplné hemolýzy na krevním agaru.

Za použití metody polymerázové řetězové reakce (PCR) lze detekovat přítomnost genů kódujících produkci jednotlivých faktorů virulence (např. emetický toxin, diarhogenní enterotoxiny, hemolyziny). Dále lze metodu využít k odlišení druhu B. cereus od ostatních blízce příbuzných druhů ze skupiny 1A (tzv. B. cereus group).

Při genotypové charakterizaci izolátů B. cereus lze mimo různých modifikací PCR (např. RAPD, RFLP-PCR) využít i metodu MLST (Multilocus Sequence Typing), ribotypizaci či microarrays.