Stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus v potravinách
Princip metody:
Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se roztírá na agarovou živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen Mannitol Yolk Polymyxine B agar (MYP). Inokulované plotny se inkubují aerobně při 30 °C po dobu 24 – 48 hodin. Následně se provede konfirmace vybraných charakteristických kolonií a úprava počtu kolonií na miskách podle výsledku konfirmace. Konfirmace spočívá v rozočkování vybraných kolonií na povrch krevního agaru (KA), po aerobní inkubaci při 30 °C po dobu 24 hodin hodnotíme hemolytickou reakci. Z počtu potvrzených suspektních kolonií vyrostlých na vybraných miskách se vypočte počet KTJ presumptivních Bacillus cereus v 1 ml nebo 1 g vzorku.
Postup metody:
Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.
Tekutý vzorek či výchozí suspenzi ostatních vzorků a jejich desetinásobná ředění očkujeme roztěrem na povrch MYP agaru v Petriho miskách, a to vždy jinou sterilní pipetou po 0,2 ml souběžně na dvě řádně označené misky. Doba mezi ukončením přípravy výchozí suspenze a okamžikem, kdy se inokulum roztírá na půdu, nesmí překročit 15 minut.
Inokulované misky necháme zaschnout po dobu asi 15 minut při laboratorní teplotě, následně je obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 24 – 48 hodin.
Alternativní metoda: z důvodu zvýšení detekčního limitu metody lze očkovat 1 ml inokula na řádně označenou Petriho misku o průměru 140 mm, příp. rozdělíme 1 ml inokula na 3 Petriho misky o průměru 90 mm (cca 0,33 ml na jednu Petriho misku) a při hodnocení sečteme počty na těchto 3 miskách dohromady.
Odečítání výsledků provádíme po 24 hodinách, nejsou-li kolonie zřetelně viditelné, inkubujeme plotny dalších 24 hodin.
Pro hodnocení použijeme misky obsahující ne více než 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Je nutné, aby jedna z těchto misek obsahovala alespoň 10 kolonií.
Po spočítání kolonií vybereme z každé Petriho misky 5 charakteristických kolonií pro konfirmaci.
Část kolonie vybrané ke konfirmaci rozočkujeme na povrch krevního agaru, po aerobní inkubaci při 30 °C po dobu 24 hodin hodnotíme hemolytickou reakci.
Jestliže je alespoň 80 % z vybraných kolonií dané misky konfirmováno jako presumptivní B. cereus, počet kolonií na misce nijak neupravujeme. V ostatních případech se počet kolonií na misce upraví podle procentuálního podílu konfirmovaných kolonjí z celkového počtu kolonií vybraných pro konfirmaci.
Schéma – stanovení počtu presumptivních Bacillus cereus v potravinách:
Morfologie charakteristických kolonií:
MYP agar – po 24 hodinách kultivace roste B. cereus ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými okraji, růžové barvy (negativní manitol), obklopených růžovou zónou precipitace. Pokud na plotnách vyrostly četné mikroorganismy, které využívají manitol za tvorby kyseliny, může být charakteristické růžové zbarvení kolonií B. cereus zeslabeno, nebo může zcela vymizet. Některé kmeny B. cereus vytvářejí málo lecitinázy, nebo ji nevytvářejí vůbec. Kolonie těchto kmenů nejsou obklopeny zónou precipitace.
KA – po 24 hodinách kultivace roste B. cereus ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými okraji, šedé barvy, obklopených různě širokou zónou β-hemolýzy. Dále je popisován typický zápach po myšině.