Termotolerantní druhy Campylobacter spp.

Základní charakteristika

Rod Campylobacter patří do čeledi Campylobacteraceae. Příslušníci tohoto rodu vyvolávají potraty a průjmová onemocnění. V posledních 30ti letech patří rod Campylobacter jako původce mezi nejčastěji diagnostikované patogeny způsobující u lidí onemocnění z potravin. Významná je skupina termofilních kampylobakterů (C. jejuni, C. coli, C. lari a C. upsaliensis) s teplotním optimem 42 °C, nejdůležitější lidský patogen je C. jejuni.

Campylobacter spp. je mikroaerofilní, nesporulující, gramnegativní tyčinka , zakřivená do tvaru S nebo spirály. Na jednom nebo obou koncích buňky je umístěn bičík, který umožňuje vývrtkovitý pohyb bakterie. Kampylobaktery jsou oxidáza pozitivní , netvoří z tryptofanu indol, redukují nitráty, ale nefermentují sacharidy.

Faktory virulence

Bakterie Campylobacter spp. produkují řadu faktorů virulence. Kolonizace střeva je umožněna pohyblivostí bakterií (chemotaxe) a produkcí adhezivních proteinů. Přežití uvnitř vakuol epiteliálních buněk je bakteriím usnadněno produkcí katalázy a superoxiddismutázy, která inaktivuje volné kyslíkové radikály. Významné pro přežití a patogenitu Campylobacter spp. je schopnost získávat železo z transferinu a laktoferinu obsažených v séru a sliznicích hostitele.

Hlavním toxinem produkovaným Campylobacter spp. je CDT (cytolethal distending toxin). Skládá se ze tří toxinů s podobnou molekulární hmotností: DdtA, CdtB, CdtC. CDT narušuje epiteliální klky, čímž je dočasně narušena absorpční funkce střeva a vzniká průjem. CDT je termolabilní (70 °C) a trypsin senzitivní.

Další toxiny produkované Campylobacter spp. jsou: enterotoxin podobný choleře, Shiga toxiny a hepatotoxin.

Další významné vlastnosti

Celosvětově rozšířená rezistence k fluorochinolonům a makrolidům především u izolátů C. jejuni a C. coli z drůbežích chovů vedla k zákazu FDA (Food and Drug Administration) používat fluorochinolony jako růstové promotory v drůbeží produkci.

Patogeneze

Infekční dávka se pohybuje v rozmezí 10² – 10⁴ bakterií, vyšší riziko infekce je u oslabených jedinců. Inkubační doba je 1 – 7 dnů (nejčastěji 24 - 48 hodin). Po průniku do trávicí soustavy Campylobacter spp. napadá epiteliální buňky v distální části ilea a v kolonu. Bakterie nejprve adherují na povrch epiteliálních střevních buněk, proniknou do nich a množí se uvnitř vakuol, kde produkují cytotoxin CDT. Výsledkem je poškození buněk a vznik zánětu, dochází ke ztrátě tekutin a průjmu. Příznakem infekce je tedy akutní enterokolitida projevující se vodnatým až krvavým průjmem trvajícím 3 - 5 dnů, horečkou, nevolností, bolestmi svalů a hlavy, křečemi obdobnými jako u zánětu slepého střeva. Onemocnění může končit úmrtím především u pacientů s oslabenou imunitou např. s onkologickým onemocněním, nemocemi jater a AIDS.

Epidemiologický význam

Počet hlášených onemocnění způsobených bakterií rodu Campylobacter se dle databáze Epidat SZÚ v České republice pohyboval mezi lety 2001 - 2010 v rozmezí 20 063 – 30 268 nemocných osob za rok. V současné době je kampylobakterióza nejčastějším onemocněním z potravin v ČR. Pro srovnání lze uvést data z USA, kde se míra výskytu Campylobacter spp. mezi lety 1996 – 2005 pohybovala v rozmezí 23,5 – 12,6 onemocnění na 100 000 obyvatel a měla klesající tendenci. 95 % humánních infekcí je způsobeno druhy C. jejuni a C. coli.

Prevencí výskytu Campylobacter spp. je důkladné tepelné opracování potravin, zamezení křížové kontaminace v průběhu zpracování a skladování potravin, dodržování nejen sanitace a desinfekce v průběhu produkce a zpracování potravin, ale i osobní hygieny osob zpracovávajících potraviny.

Výskyt v surovinách a potravinách

Hlavním rezervoárem Campylobacter spp. je zažívací trakt hospodářská zvířat (C. jejuni a C. coli), domácích mazlíčků (C. upsaliensis), ptáků (u racků C. lari) i člověka. Bakterie lze izolovat ze syrových potravin, a to především z potravin živočišného původu, dále ze zeleniny (rizikem je hnojení statkovými hnojivy), mořských plodů a vody. Příčinou epidemií jsou zpravidla drůbeží produkty (nedostatečně tepelně opracované drůbeží maso), nepasterované mléko, sekundární kontaminace při zpracování potravin (nízká infekční dávka umožňuje přímý přenos kontaminovanýma rukama), kontaminovaná povrchová voda a především také křížová kontaminace v domácnostech nebo v provozech veřejného stravování.

Campylobacter spp. je součástí střevní mikroflóry, odkud se dostává do prostředí porážek. Ve střevním obsahu brojlerů se nachází v průměru 10⁶ - 10⁷ KTJ.g^-1 kampylobakterů a převládá výskyt druhů C. jejuni a C. coli. U prasat je nejčastějším druhem C. coli.

Vliv vnějších a vnitřních faktorů a technologických procesů

Tento velmi úspěšný původce onemocnění z potravin má přísné nároky na své růstové podmínky, proto se běžně v potravinách nemnoží, pouze přežívá. Campylobacter spp. je mikroaerofilní a vyžaduje v atmosféře přítomnost 3 – 5 % O₂ a 3 – 10 % CO₂. Je citlivý zejména k vyšší přítomnosti kyslíku a v aerobní atmosféře rychle hyne.

Teplotní optimum pro skupinu termofilních kampylobakterů je 42 °C, nerostou pod 30 °C a nad 45 °C. Campylobacter spp. je citlivý k tepelnému opracování (D₅₅ = 1 min) a nepřežívá pasteraci. Chladírenské teploty 4 °C mohou redukovat počty bakterií (např. v másle přežívá při 5 °C po dobu 13 dnů). Mražením jsou počty redukovány, nikoliv eliminovány.

Růst může být dále limitován koncentrací NaCl (2 %), pH nižším než 4,9 (optimum 6,5 - 7,5) a snížením aktivity vody pod 0,98 (v suchém prostředí nepřežívá). Při stejných hodnotách pH kyselina mléčná inhibuje růst Campylobacter spp. více než kyselina chlorovodíková. Použití organických kyselin se v některých státech používá k eliminaci kampylobakterů na tělech jatečně opracované drůbeže před jejich chlazením.

Metody stanovení v potravinách

Kampylobaktery se množí mnohem pomaleji než ostatní střevní baktérie a proto je nutné kultivační média doplnit antibiotickými suplementy, které brzdí růst kontaminující mikroflóry. Suspektní kolonie jsou konfirmovány biochemicky (kataláza, oxidáza, produkce H₂S), dále podle schopnosti růstu při 25 °C a za aerobních podmínek při 42 °C.

Průkaz termotolerantních kampylobakterů se provádí podle ČSN EN ISO 10272-1. Vzorky analyzovaných potravin se musí vzhledem ke speciálním nárokům na přežívání Campylobacter spp. zpracovat co nejdříve. Průkaz v potravinách zahrnuje 3 po sobě jdoucí stupně: jednostupňové pomnožení v tekuté selektivní půdě – bujón podle Boltona s koňskou hemolyzovanou krví , izolaci na 2 selektivní agarová média – modifikovaný deoxycholátový agar s aktivním uhlím a cefoperazonem (mCCDA) a další selektivní půdu založenou na jiném principu než mCCDA, např. agar podle Karmaliho či agar podle Prestona. Následně se provede biochemická konfirmace vybraných suspektních kolonií. Pro růst a množení Campylobacter spp. je nezbytné použít vyvíječe plynu, které vytvoří v anaerostatu mikroaerofilní prostředí s 5 % O₂, 10 % CO₂ a 85 % N₂.

Alternativní způsoby detekce kampylobakterů v potravinách využívají zejména imunochemických metod – metoda ELFA nebo imunochromatografická metoda .

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci

Mimo charakteristického vzhledu kolonií na určených selektivně-diagnostických půdách představuje základní konfirmace hodnocení morfologie buněk po obarvení dle Grama, testování pohyblivosti, mikroaerofilního růstu při 25 °C, aerobního růstu při 42 °C a průkaz oxidázy. K druhové identifikaci lze využít: průkaz katalázy , stanovení citlivosti ke kyselině nalidixové a cephalotinu, průkaz hydrolýzy hippurátu sodného a indoxyl acetátu.

Pro konfirmaci suspektních izolátů termotolerantních kampylobakterů lze využít i latexaglutinační soupravy (např. Dryspot Campylobacter test).

Molekulárně-biologické metody (např. PCR ) lze využít ke konfirmaci a druhové identifikaci kampylobakterů, detekci genů kódujících tvorbu faktorů virulence či genů kódujících rezistenci k antimikrobiálním látkám.