Stanovení termotolerantních druhů Campylobacter spp. v potravinách
Princip metody:
Zkoušený vzorek se inokuluje do tekuté půdy pro selektivní pomnožení – bujón podle Boltona s koňskou hemolyzovanou krví a inkubuje se mikroaerofilně při 37 °C po dobu 4 – 6 hodin a následně při 42 °C po dobu 48 hodin. Získaná kultura ze selektivního pomnožení se vyočkuje na 2 pevné selektivní půdy – modifikovaný deoxycholátový agar s aktivním uhlím a cefoperazonem (mCCDA agar) a další selektivní půdu založenou na jiném principu než mCCDA, např. agar podle Karmaliho či agar podle Prestona. Inokulované misky se inkubují mikroaerofilně při 42 °C po dobu 48 hodin a zjišťuje se přítomnost suspektních kolonií termotolerantních druhů rodu Campylobacter. Následně se provede biochemická konfirmace vybraných suspektních kolonií. Výsledkem je průkaz přítomnosti či absence termotolerantních baktérií rodu Campylobacter v navážce vyšetřovaného vzorku.
Postup metody:
Selektivní pomnožení: odebereme zkušební vzorek (obvykle 25 g nebo 25 ml) a připravíme výchozí ředění, jako ředící roztok použijeme devítinásobné množství (tj. 225 ml) bujónu podle Boltona. Inkubujeme mikroaerofilně v termostatu při 37 °C po dobu 4 – 6 hodin a následně při 42 °C po dobu 48 hodin.
Izolace: z půdy pro selektivní pomnožení provedeme vyočkování sterilní bakteriologickou kličkou na 2 selektivní agarová média – mCCDA a Karmali agar. Inokulované Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme mikroaerofilně v termostatu při 42 °C po dobu 48 hodin.
Alternativní metoda: Předpokládáme-li ve vyšetřovaném vzorku přítomnost velkého množství termotolerantních kampylobakterů, provedeme z výchozí suspenze vyočkování sterilní bakteriologickou kličkou přímo na povrch selektivních agarových půd, a to bez předchozího pomnožení.
Při hodnocení sledujeme nárůst kolonií charakteristických pro termotolerantní druhy rodu Campylobacter, pro konfirmaci náhodně vybereme z každé plotny 5 charakteristických kolonií.
Základní konfirmace představuje hodnocení morfologie buněk po obarvení dle Grama, testování pohyblivosti, mikroaerofilního růstu při 25 °C, aerobního růstu při 42 °C a průkaz oxidázy. Ke druhové identifikaci lze využít: průkaz katalázy, stanovení citlivosti ke kyselině nalidixové a cephalotinu, průkaz hydrolýzy hippurátu sodného a indoxyl acetátu.
Na základě výsledků konfirmace potvrdíme nebo vyloučíme přítomnost termotolerantních druhů rodu Campylobacter v navážce vyšetřovaného vzorku.
Schéma – stanovení termotolerantních druhů Campylobacter spp. v potravinách:
Morfologie charakteristických kolonií:
mCCDA agar – po 48 hodinách inkubace jsou charakteristické kolonie šedavě zbarvené často s kovovým leskem, ploché a vlhké s tendencí se rozrůstat.
Karmali agar – po 48 hodinách inkubace jsou charakteristické kolonie šedavě zbarvené, ploché a vlhké s tendencí se rozrůstat.
Vybrané znaky druhů rodu Campylobacter rostoucích při 42 °C:
