STEC – Shiga-like toxigenní Escherichia coli

Základní charakteristika

Escherichia coli (rod Escherichia, čeleď Enterobacteriaceae) je fakultativně anaerobní, nesporotvorná, krátká gramnegativní tyčinka, pohyblivá díky přítomnosti peritrichálních bičíků. Vyskytuje se jednotlivě, ve dvojicích nebo krátkých řetízcích. Velikout vegetativních buněk je v průměru 1-1,5 x 2-6 µm. Na povrchu buňky se vyskytují různé druhy fimbrií, které bakteriím umožňují adherenci k hostitelským buňkám (např. střevní epitelie). V menší míře se vyskytují i tzv. sex pili, které umožňují vazbu mezi donorem a recipientní buňkou při konjugaci. Některé kmeny E. coli tvoří polysacharidová pouzdra a jejich kolonie mají hlenovitý charakter.

E. coli je oxidáza negativní, fermentuje glukózu a další cukry za tvorby kyselin a plynu (CO₂, O₂), většina kmenů fermentuje laktózu během 48 hodin a D-sorbitol během 24 hodin. Je VP-test negativní, citrát negativní, tvoří z tryptofanu indol (95%). Obvyklá je i aktivita enzymu ß-D-glukuronidázy a ß-D-galaktosidázy, jejichž průkazu se využívá při detekci E. coli v potravinách. Některé patogenní kmeny jsou acidorezistentní.

Poněkud odlišné biochemické vlastnosti mají kmeny E. coli O157:H7, které nemají enzym ß-D-glukuronidázu a nejsou schopny fermentovat D-sorbitol.

Sérotypy E. coli

Sérotypizace E. coli je založena na detekci somatických O-antigenů (174 typů), bičíkových H-antigenů (53 typů) a kapsulárních K-antigenů (80 typů). O-antigen identifikuje séroskupinu, H-antigen potom konkrétní sérotyp.

Virotypy E. coli

Virotypizace je klasifikace založená na přítomnosti určitých faktorů virulence, způsobu jejich interakce s hostitelskými buňkami a tkáněmi a produkci toxinů. Patogenní E. coli jsou klasifikovány do 6 virotypů:

1. Enterotoxigenní E. coli (ETEC)

2. Enteropatogenní E. coli (EPEC)

3. Enterohemorhagické E. coli (EHEC), nebo též Shiga-like toxigenní E. coli (STEC)

4. Enteroinvazivní E. coli (EIEC)

5. Enteroagragativní E. coli (EAEC)

6. Difúzně adherentní E. coli (DAEC).

Faktory virulence

Kmeny STEC produkují řadu faktorů virulence, mezi nejvýznamnější patří shiga-like toxiny, hemolyziny a intimin. Dále jsou to např. extracelulární serinproteáza, sekreční systém III. typu (TTSS), flagelin, fimbriální adheziny, atd.

Shiga-like toxiny: STEC produkují dva typy toxinů – Stx1 a Stx2, které mají několik variant. Pro jejich cytotoxický účinek na buněčné kultury Vero buněk, jsou tyto toxiny nazývány také jako verocytotoxiny (VT1 a VT2). Toxin Stx1 je velmi podobný Stx toxinu produkovanému Shigella dysenteriae typ 1. Toxin Stx2 je asi 1000x toxičtější než Stx1. Toxiny Stx se skládají ze dvou podjednotek – A a B. Podjednotka B se specificky váže na povrch eukaryotních buněk. Následně dochází k odštěpení podjednotky A a k jejímu průniku do buňky, kde působí inhibici proteosyntézy na úrovni endoplazmatického retikula.

Kmeny STEC produkují dva typy hemolyzinů. První je produkován kmeny způsobujícími edémovou chorobu prasat (produkují toxin Stx2e), druhý je izolován výhradně z kmenů humánního původu. Oba typy hemolyzinů jsou kódovány plazmidy.

Intimin je zodpovědný za těsné ulpění bakterií na střevní buňky a podílí se na vymizení mikrovili při vzniku tzv. attachment-effacement lézí.

Další významné vlastnosti

Bakterie Escherichia coli bývá při mikrobiologické analýze používána zejména k posouzení hygienické kvality potravin a potravinových surovin. Další její významnou vlastností je rezistence k antimikrobiálním látkám. Úroveň antibiotické rezistence E. coli je považována za vhodný indikátor selekčního tlaku způsobeného užíváním antibiotik. Mimo to patří E. coli mezi mikroorganismy schopné přenášet geny rezistence na příbuzné i nepříbuzné druhy patogenních bakterií, proto je přítomnost rezistentních kmenů v prostředí i potravinách nežádoucí.

Mezi nejčastěji sledované rezistence bakterií E. coli patří rezistence k β-laktamovým antibiotikům, tetracyklinům a chinolonům, zejména díky jejich časté aplikaci v humánní i veterinární medicíně. Mezi nejvýznamnější enzymy štěpící β-laktamová antibiotika patří širokospektré β-laktamázy (ESBL), hydrolyzující peniciliny, cefalosporiny všech generací a monobaktamy. Další významnou skupinou jsou E. coli rezistentní k chinolonům a fluorochinolonům.

Zatímco rezistence k β-laktamovým antibiotikům je zapříčiněna jejich enzymatickou inaktivací, rezistence k tetracyklinům a chinolonům je nejčastěji způsobena změnou cílového místa působení antimikrobiální látky nebo snížením intracelulární koncentrace antibiotika pomocí účinného efflux-systému.

Patogeneze

Patogenní kmeny E. coli mohou způsobit různá onemocnění intestinálního i extraintestinálního charakteru – gastroenteritidy, dyzenterie, hemolyticko-uremický syndrom, infekce močového traktu, septikémie, pneumonie a meningitidy.

Enterohemorhagické E. coli (EHEC), označované též jako shiga-like toxigenní E. coli (STEC) či verotoxigenní E. coli (VTEC), způsobují krvavé průjmy a hemolyticko-uremický syndrom. Onemocnění se vyskytuje zejména ve vyspělých zemích. STEC se dále dělí do 5 séropatotypů (A – E) na základě četnosti nákazy a průběhu onemocnění. Mezi nejčastější séroskupiny patří O4, O5, O16, O26, O55, O111ab, O113, O117, O157 a O172. Nejznámějším sérotypem je O157:H7.

Po vstupu do organismu kolonizují STEC střevo a způsobují zde tzv. attachment-effacement léze na střevní sliznici (podobnost s EPEC). Pomocí fimbrií bakterie adherují na mikrovili střevních epiteliálních buněk, následně dojde k aktivaci polymerace aktinu, přeskupení cytoskeletu uvnitř buněk a k vymizení mikrovili. Současně se naruší permeabilita membrány střevních buněk. Vznik attachment-effacement lézí vede k následnému odlupování epitelií, vzniku zánětu a průjmu. Změny jsou lokalizovány v tlustém střevě.

Současně dochází k produkci shiga-like toxinů, které mají nefrotoxickou, cytotoxickou, enterotoxickou a neurotoxickou aktivitu. Při postižení ledvin dochází k masivnímu poškození ledvinových tubulů, moč obsahuje krev a vyvíjí se hemolyticko-uremický syndrom. Neurotoxický účinek shiga-like toxinů se projevuje vznikem tzv. trombotické trombocytopenické purpury. Enterotoxický účinek Stx toxinů vede k hromadění tekutiny ve střevě a ke vzniku průjmu. Cytotoxické působení je dáno inhibicí proteosyntézy v buňkách a vede k tzv. buněčné smrti.

První symptomy infekce STEC se objevují 3 – 9 dní po konzumaci kontaminované potraviny a obvykle přetrvávají 4 – 10 dní. Infekční dávka je velmi nízká, uvádí se 50 – 100 bakterií. Mírná forma onemocnění se projevuje jako kolitida, zahrnující náhlé abdominální bolesti, vodnatý, později krvavý průjem a zvracení. Postupně se vyvíjí hemorhagická kolitida, pro kterou je typická krvavě červená stolice. U 5 – 10 % pacientů (zejména u malých dětí) se následně rozvíjí hemolyticko-uremický syndrom (HUS) charakterizovaný akutním selháním ledvin, hemolytickou anémií a trombocytopénií. Chronické poškození ledvin vede k nutnosti opakované dialýzy a následné transplantace ledvin. Třetí klinickou manifestací infekce STEC je trombotická trombocytopenická purpura (TTP), která se obvykle vyskytuje u dospělých. Pro TTP je charakteristická hemolýza, trombocytopenie, selhání ledvin a kolísavá horečka. Typickými projevy jsou poruchy CNS podmíněné vznikem krevních sraženin v mozku. Fatální průběh mívá onemocnění STEC zejména u dětí do 5ti let a starších osob.

Epidemiologický význam

Většina kmenů E. coli je nepatogenních a tvoří běžnou součást střevní mikroflóry člověka a teplokrevných zvířat. Běžně se využívá jako modelový organismus pro studium fyziologie bakterií, jejich metabolismu, genetické regulace či stavby a funkce buněčné stěny.

K přenosu infekce STEC na člověka dochází nejčastěji kontaminovanými potravinami. Vzhledem k velmi nízké infekční dávce (méně než 50 bakterií) je další možnou cestou šíření fekálně-orální přenos z člověka na člověka nebo ze zvířat na člověka (např. epidemie v jeslích či mateřských školkách).

Spolehlivou ochranou před kontaminací STEC je dostatečná úroveň hygieny a dobrý sanitační režim při dojení, používání pitné vody a správné tepelné ošetření syrového mléka. Důležitým preventivním krokem je také zamezení postpasterační a případné křížové kontaminace tepelně ošetřených potravin. Z pohledu spotřebitele je to především konzumace dostatečně tepelně ošetřeného masa (zejména hovězího), pasterovaného mléka a mléčných výrobků.

Výskyt v surovinách a potravinách

E. coli je běžnou součástí střevní mikroflóry teplokrevných zvířat. Primárním zdrojem STEC jsou přežvýkavci, zejména skot, byla izolována také z ostatních domácích i volně žijících zvířat, ptáků, hlodavců a hmyzu. Prostřednictvím výkalů se STEC dostávají do zevního prostředí, kde se pomnožují, kontaminují vodu a půdu, při hnojení statkovými hnojivy i ovoce a zeleninu. Ke kontaminaci syrového mléka dochází při dojení, příp. i přímým vylučováním E. coli při coli-mastitidách. Maso je obvykle kontaminováno v průběhu porážení.

Mezi rizikové potraviny patří zejména tepelně neopracované či nedostatečně tepelně opracované potraviny živočišného původu – mleté hovězí maso, syrové mléko a výrobky ze syrového mléka. Díky své acidotoleranci mohou STEC kontaminovat i zeleninu, ovoce a ovocné produkty (např. nepasterované džusy a šťávy) či další potraviny se sníženým pH (např. majonéza). Vzhledem k velmi nízké infekční dávce je dalším možným zdrojem infekce STEC nedostatečně chlorovaná pitná voda či koupání v kontaminovaných vodních zdrojích.

Vliv vnějších a vnitřních faktorů a technologických procesů

E. coli roste v teplotním rozmezí 7 – 45 °C, optimum je 30 – 37 °C. Je citlivá k záhřevu, pasterační teploty ji devitalizují. Roste při pH 4 – 10, s optimem v rozmezí 6 – 7. Minimální aktivita vody pro růst a množení je 0,95. Dobře roste při obsahu NaCl do 2,5 %, ale je schopna za určitých podmínek tolerovat i koncentrace vyšší (6 – 8 %). E. coli dobře snáší mražení.

Kmeny E. coli O157:H7 špatně rostou při 44 – 45 °C. Jsou acidotolerantní a dobře přežívají i v kyselých potravinách (pH 3,6 – 4,0), a to především při snížené teplotě.

Metody stanovení v potravinách

Pro průkaz Escherichia coli v potravinách se využívá selekčního tlaku zvýšené kultivační teploty (44 – 45 °C) a selekčních činidel potlačujících růst grampozitivních bakterií (např. žlučové soli, tergitol či laurylsulfát). Z biochemických vlastností je to schopnost vytvářet z tryptofanu indol a průkaz aktivity enzymu β-D-glukuronidázy. Současný trend směřuje k používání chromogenních médií.

Ke stanovení počtu E. coli se běžně používají půdy s jedním chromogenem pro průkaz β-D-glukuronidázy, který obsahuje modrozelený chromofor. Dále lze použít půdy s dvěma chromogeny – pro průkaz β-D-glukuronidázy (modrozelený chromofor) a pro průkaz β-D-galaktosidásy (lososově červený chromofor), které umožňují odlišit E. coli (modrofialová – obsahuje oba enzymy), další koliformní bakterie a β-D-glukuronidázonegativní kmeny E. coli (červená – obsahují pouze β-D-galaktosidázu) a další gramnegativní bakterie (bezbarvé – nemají žádný z uvedených enzymů).

Na rozdíl od stanovení běžných E. coli je diagnostika E. coli O157:H7 založena na průkazu absence enzymu ß-D-glukuronidázy, tvorbě indolu a neschopnosti štěpit sorbitol. Kultivační teplota nepřesahuje 41,5 °C. Pozn. Existují i sorbitol pozitivní kmeny a indol negativní mutanty.

Stanovení E. coli O157 v potravinách se provádí kvalitativně. Ke kultivaci se používají selektivní média obsahující látky inhibující růst doprovodné mikroflóry (např. chlorid sodný, žlučové soli, krystalová violeť, teluričitan draselný, antibiotika – novobiocin, cefixim) a dále sorbitol. Suspektní kolonie jsou konfirmovány biochemicky a sérologicky.

Podle ČSN EN ISO 16654 (2002) zahrnuje stanovení E. coli O157 čtyři po sobě jdoucí stupně. Vzorek se nejdříve homogenizuje v  modifikovaném bujonu s enzymaticky natráveným kaseinem a sójou s přídavkem novobiocinu (mTSB + N). Poté se bakterie koncentrují a separují pomocí imunomagnetických částic, na jejichž povrchu je nanesena specifická protilátka proti antigenu O157. Následná izolace bakterií se provádí subkultivací na selektivních půdách – MacConkey agar s cefiximem, teluričitanem draselným a sorbitolem (CT-SMAC) a dále na druhé selektivní půdě (např. SMAC s BCIG, chromogenní agar).

Jako alternativu ke klasickému kultivačnímu stanovení E. coli O157 lze využít také metodu ELFA, která je dostatečně specifická a výrazně zkracuje dobu potřebnou k dosažení výsledků.

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci

Spolu s typickou morfologií kolonií na selektivně-diagnostických půdách se hodnotí tvorba indolu a β-D-glukuronidázová aktivita. Pro přesnou identifikaci izolátů lze využít biochemické testovací soupravy (např. ENTEROtest, API test). U patogenních kmenů se provádí sérotypizace sklíčkovou aglutinací za použití specifických protilátek proti somatickým O-antigenům, příp. bičíkovým H-antigenů.

K detekci produkce shiga-like toxinů lze využít komerčně dostupné kity na bázi imunochemických metod – imunochromatografickou metodu, reverzní pasivní latexovou aglutinaci či ELISA metodu.

Za použití metody polymerázové řetězové reakce (PCR) lze detekovat přítomnost genů kódujících produkci jednotlivých faktorů virulence (např. hemolyziny, intimin, shiga-like toxiny), příp. geny rezistence k antimikrobiálním látkám.

Při genotypové charakterizaci izolátů STEC lze mimo různých modifikací PCR (např. multiplex či real-time PCR, RFLP-PCR) využít i metodu pulzní gelové elektroforézy (PFGE).