Stanovení počtu Staphylococcus aureus v potravinách
Princip metody:
Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních vzorků a jejich desetinásobných ředění se roztírá na agarovou živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen Baird-Parker agar (B-P agar) s vaječnou emulzí a teluričitanem draselným. Inokulované plotny se inkubují aerobně při 37 °C po dobu 24 – 48 hodin. Následně se provede konfirmace vybraných typických a atypických kolonií (koagulázový test) a úprava počtu kolonií na miskách podle výsledku konfirmace. Z počtu potvrzených suspektních kolonií vyrostlých na vybraných miskách se vypočte počet koagulázopozitivních stafylokoků, resp. Staphylococcus aureus, v 1 ml nebo 1 g vzorku.
Postup metody:
Odebereme zkušební vzorek a připravíme výchozí ředění a tolik dalších desetinásobných ředění, aby bylo možno stanovit předpokládaný počet mikroorganismů.
Tekutý vzorek či výchozí suspenzi ostatních vzorků a jejich desetinásobná ředění očkujeme roztěrem na povrch B-P agaru v Petriho miskách, a to vždy jinou sterilní pipetou po 0,2 ml souběžně na dvě řádně označené misky. Doba mezi ukončením přípravy výchozí suspenze a okamžikem, kdy se inokulum roztírá na půdu, nesmí překročit 15 minut.
Inokulované misky necháme zaschnout po dobu asi 15 minut při laboratorní teplotě, následně je obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 24 – 48 hodin.
První odečítání provádíme po 24 hodinách, výsledný počet se zjistí po ukončení inkubace, tj. po 48 hodinách. Při hodnocení zaznamenáváme počet typických i atypických kolonií.
Pro hodnocení použijeme misky obsahující ne více než 300 kolonií včetně 150 typických či atypických ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Je nutné, aby jedna z těchto misek obsahovala alespoň 10 kolonií.
Po spočítání kolonií vybereme z každé plotny charakteristické kolonie pro konfirmaci. Obecně vybíráme 5 typických kolonií, jsou-li přítomny pouze typické kolonie, nebo 5 atypických kolonií, jsou-li přítomny pouze atypické kolonie, nebo 5 typických a 5 atypických, jsou-li přítomny oba typy.
Konfirmace vybraných kolonií spočívá v provedení koagulázového testu. Vybraná kolonie se sterilní bakteriologickou kličkou přenese do zkumavky s mozkosrdcovou infuzí a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Poté se ve sterilní zkumavce smíchá 0,1 ml suspenze a 0,3 ml králičí plazmy a inkubuje se při teplotě 37 °C. Po 4 – 6 hodinách, resp. 24 hodinách, sledujeme zda došlo ke koagulaci více než poloviny přidané plazmy. Současně provedeme negativní kontrolu se sterilní mozkosrdcovou infuzí.
Jestliže alespoň 80 % z vybraných kolonií dané misky je koagulázopozitivních, počet kolonií na misce nijak neupravujeme. V ostatních případech se počet kolonií na misce upraví podle procentuálního podílu koagulázopozitivních kolonií z celkového počtu kolonií vybraných pro konfirmaci.
Schéma – stanovení počtu Staphylococcus aureus v potravinách:
Morfologie charakteristických kolonií:
Po 24 hodinách kultivace mají kolonie narostlé na B-P agaru následující morfologii:
typické kolonie – kolonie černé nebo černošedé barvy, lesklé a vypouklé, o průměru 1 – 1,5 mm, obklopené zónou projasnění, v zóně projasnění se může objevit opalescentní prstenec;
atypické kolonie – kolonie černé, lesklé, s úzkým bílým okrajem nebo bez něj, zóna projasnění a opalescentní prstenec chybí nebo jsou sotva viditelné anebo šedé kolonie bez zóny projasnění.