Průkaz přítomnosti vázané koagulázy
Princip metody:
Vázaná koaguláza (angl. clumping factor) je povrchový protein schopný vázat fibrinogen a měnit jej na fibrin, čímž dochází k typickému shlukování buněk stafylokoků. Její přítomnost je typická především pro druh Staphylococcus aureus. Princip stanovení vázané koagulázy spočívá v reakci s fibrinogenem králičí plazmy, která se projeví shlukováním buněk (aglutinace). Vizuálně dochází k vyjasnění původně mléčné suspenze a k tvorbě viditelných shluků.
Pracovní postup:
Na čisté podložní sklo naneseme několik kapek sterilního fyziologického roztoku. Sterilní bakteriologickou kličkou nabereme testovanou kulturu a rozetřeme ji ve fyziologickém roztoku tak, aby vznikla mléčně zakalená suspenze. K suspenzi přidáme kapku králičí plazmy a kličkou směs dobře promícháme. Současně provedeme negativní kontrolu, kdy místo králičí plazmy smícháme bakteriální suspenzi s fyziologickým roztokem.
Hodnocení:
Proti černému pozadí pozorujeme zda do 2 minut dochází k projasnění suspenze a ke vzniku viditelných shluků.
Clumping faktor lze také prokázat použitím komerčně dostupných latexových aglutinačních reagencií (např. Dryspot Staphytest Plus).
Průkaz přítomnosti volné koagulázy
Princip metody:
Volná koaguláza je extracelulární enzym schopný reagovat s plazmatickým faktorem za vzniku tzv. stafylotrombinu. Stafylotrombin katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin. Přítomnost volné koagulázy je opět typická především pro druh Staphylococcus aureus. Princip stanovení volné koagulázy spočívá v reakci s fibrinogenem králičí plazmy, která se projeví tvorbou chuchvalců, sraženin či úplným ztuhnutím plazmy ve zkumavce.
Pracovní postup:
Do aglutinační zkumavky napipetujeme 0,5 ml roztoku králičí plazmy a přidáme 0,1 ml osmnáctihodinové bujónové kultury testovaného kmene nebo do plazmy rozetřeme několik kolonií z pevného média. Směs dobře promícháme a inkubujeme 3 hodiny při 37 °C a pak do druhého dne při laboratorní teplotě.
Hodnocení:
Výsledek testu odečítáme po 1, 3 a 24 hodinách. V případě pozitivní reakce dojde ke ztuhnutí plazmy nebo k vytvoření chuchvalců či sraženin. Intenzitu pozitivní reakce hodnotíme na 1+, 2+, 3+ a 4+.
Vyhodnocení stanovení volné koagulázy: