Salmonella spp.

Základní charakteristika

Salmonely jsou původci gastroenteritidy a tyfoidní horečky a celosvětově patří mezi nejvýznamnější patogeny způsobující onemocnění z potravin. Rod Salmonella patří do čeledi Enterobacteriaceae, je to fakultativně anaerobní, nesporulující, gramnegativní tyčinka velikosti 0,7 – 1,5 x 2 – 5 µm. Salmonely jsou pohyblivé díky 4 – 5 peritrichálním bičíkům (s výjimkou S. Pullorum a S. Gallinarum), povrch těla většiny salmonel je pokryt fimbriemi adhezivního typu.

Salmonely zkvašují glukózu, jsou laktóza negativní, kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Většina salmonel (s výjimkou S. Typhi) využívá jako zdroj uhlíku citráty, dekarboxylují lyzin, arginin a ornitin, produkují sirovodík. Test s methyl červení je pozitivní, V-P test a indol negativní.

V praxi lze salmonely rozdělit na sérotypy, které jsou primárně patogenní pro člověka a jsou příčinou závažných systémových onemocnění - tyfů a paratyfů (sérotypy Typhi a Paratyphi) a dále na původce tzv. salmonelóz – tj. průjmových onemocnění, způsobených převážně zoopatogenními kmeny salmonel. Zoopatogenní salmonely jsou v současné době spolu s kampylobaktery nejčastějšími původci bakteriálních střevních nákaz.

Historicky byly nově objevené sérotypy salmonel považovány za jednotlivé druhy a zpravidla byly pojmenovávány dle místa objevu (např. S. miami, S. london, S. tenessee). Nový pohled na taxonomii salmonel však přinesl jejich rozdělení podle somatických (O), bičíkových (H) a kapsulárních (Vi) antigenů. V dnešní době jsou tedy salmonely rozděleny do dvou druhů: S. enterica a S. bongori. S. enterica má nyní šest poddruhů: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae a indica. Všechny salmonely běžně významné pro člověka patří do prvního druhu Salmonella enterica a většinou do poddruhu S. enterica ssp. enterica. Kompletní název jednotlivých sérotypů např. S. enterica ssp. enterica sérovar Enteritidis tak ze zvyku a z praktických důvodů bývá uváděn zkráceně jako S. Enteritidis. To, že se ve zkráceném názvu jedná o sérotyp a nikoliv o druhové jméno, ukazuje velké písmeno na začátku a absence kurzívy.

Faktory virulence

Faktory virulence jsou kódovány geny, které jsou seskupeny na specifických oblastech chromozomu, nazývaných ostrovy patogenity. Ostrovy patogenity jsou genetické elementy zvyšující virulenci bakterií a přispívající ke genetické přizpůsobivosti bakteriálních druhů. U salmonel jsou tyto označovány „Salmonella pathogenicity island“ (SPI). Poprvé byly popsány v létech 1995 a 1996 u Salmonella Typhimurium. Doposud bylo popsáno 14 různých SPI, označených SPI-1 až SPI-14.

Nejvýznamnějšími faktory virulence jsou u salmonel endotoxin a enterotoxin. Endotoxiny jsou součástí povrchové membrány gramnegativních bakterií. U salmonel je endotoxin spojován s O antigenním polysacharidem, lokalizovaným na povrchu vnější membrány. O antigen tvoří nejsvrchnější část lipopolysacharidu, přičemž antigen chrání salmonelu před bakteriolytickým účinkem komplementu. Pomocí O antigenu tak lze rozlišit skupiny nazývané také O séroskupiny. Například Salmonella Enteritidis patří do skupiny O:9. Endotoxin vyvolává horečku a klinické příznaky akutní gastroenteriditidy a celkovou intoxikaci, která se rozvíjí několik hodin po konzumaci kontaminované potraviny.

Některé sérotypy salmonel produkují enterotoxiny jak termolabilní (LT), které jsou strukturálně i funkčně blízké enterotoxinům popisovaným u Vibrio cholerae, tak i termostabilní (ST) známé u E. coli. Jejich účinky sice nebyly přesně popsány, ale předpokládá se, že hrají důležitou roli u průjmových onemocnění bakteriálního původu.

Další významné vlastnosti

Salmonely jsou většinou citlivé k antimikrobiálním a desinfekčním látkám. V poslední době však roste podíl multirezistentních kmenů např. v rámci sérotypu Typhimurium a Hadar, které vykazují rezistenci k více antimikrobiálním látkám současně. Jde o kmeny (především kmen S. Typhymurium označovaný DT 104) rezistentní k ampicilinu a několika dalším antibiotikům.

V klinické praxi i v potravinářském průmyslu je významnou vlastností salmonel schopnost přilnout k povrchům a zde následně vytvářet biofilmy.

Patogeneze

Zoopatogenní salmonely jsou u nás nejběžnějším původcem bakteriálních nákaz. Ve většině případů jde o klasickou střevní infekci bez komplikací. Inkubační doba je 12 hodin až 5 dnů, nejčastěji 24 – 48 hodin. Charakteristické jsou průjmy s velkou frekvencí stolic, ale bez přítomnosti krve ve stolici. Někdy se objevuje i zvracení, téměř vždy je přítomna horečka. U malých dětí, starších a oslabených osob hrozí salmonelová sepse, která může být smrtelná. Infekční dávka je uváděna v rozmezí 10⁵ – 10⁸ bakterií, jsou však popisovány případy vyvolané dávkami mnohem nižšími, zvláště u dětí, starších osob a pacientů s oslabenou imunitou.

Salmonely se v zažívacím traktu váží pomocí specifických adhesinů svého povrchu na mikrovili sliznice střeva – především v oblasti ilea, slepého střeva a proximálního kolonu. Dochází k degeneraci mikrovilů, salmonely pronikají do buněk enterocytů a množí se v nich. Množí se také v lymfatické tkáni (makrofágy Peyerových plaků). V buňkách se salmonely nemnoží v cytoplasmě, ale setrvávají ve fagosomálních vakuolách a jejich množení je proto pomalejší. K septikémii dochází po rozpadu buněk, kdy se salmonely dostávají do krevního oběhu.

Při salmonelóze se nedoporučuje antibiotická terapie, která sice může zkrátit dobu trvání klinických příznaků, avšak prodlouží dobu vylučování salmonel. Jako součást léčby se doporučuje podávat probiotika (bakterie, které mají schopnost stát se součástí střevní mikroflóry), a to buď v léčebných preparátech, nebo jako součást potravin (kysané mléčné výrobky, kysané zelí). Antibiotika se podávají jen v případě mimostřevních komplikací. Salmonely jsou do okolního prostředí vylučovány pacienty nejen během akutní fáze onemocnění, která se projevuje typickými klinickými příznaky, ale i po odeznění těchto příznaků, a to po dobu až několika měsíců. Tato skutečnost může představovat významný problém u osob zaměstnaných nebo jinak spojených s potravinářskou výrobou.

Epidemiologický význam

Salmonelóza je typická fekálně-orální infekce. Vehikulem pro přenos bývá téměř vždy potravina. Přenos z člověka na člověka je vzácný. Počet salmonelóz měl dle databáze Epidat SZÚ v České republice mezi lety 2001 – 2010 klesající tendenci. Počet hlášených nemocných osob v roce 2001 byl 33594 a postupně se snižoval až na 8622 v roce 2010. V současné době je v ČR po kampylobakterióze salmonelóza druhým nejčastějším onemocněním z potravin.

K důležité prevenci salmonelózy patří zabránění sekundární kontaminace potravin při přípravě pokrmů a v potravinářském průmyslu. Dále je kromě běžných hygienických pravidel nutno používat dostatečně vysoké teploty při zpracování potravin a dostatečně nízké teploty při jejich uchovávání.

Výskyt v surovinách a potravinách

Salmonely se běžně nachází v zažívacím traktu ptáků, plazů, hmyzu, zvířat a člověka. Jsou vylučovány fekáliemi a kontaminují životní prostředí a potraviny. Častým rezervoárem salmonel jsou vejce, zvláště u sérotypu Enteritidis, kdy salmonely mohou kolonizovat ovaria u nosnic a tímto tzv. transovariálním přenosem se salmonely stávají součástí vejce ještě před jeho dalším formováním ve vejcovodu. Pokud jsou takto kontaminovaná vejce skladována při pokojové teplotě, koncentrace salmonel v jednom vejci může dosáhnout počtů vyšších než 10¹¹ buněk.

Příčinou salmonelóz člověka bývá především syrové maso (nejčastěji drůbeží a vepřové). Dále mohou být kontaminovány cukrářské a lahůdkářské výrobky, u kterých je vysoký podíl ruční práce. Riziková je konzumace syrového mléka.

Vliv vnějších a vnitřních faktorů a technologických procesů

Minimální teplota růstu salmonel je 5 °C, maximální 47 °C, optimální kolem 37 °C. Salmonely běžně nepřežívají sterilační ani pasterační teploty. Teplota kolem 60 °C by salmonely v potravinách měla zničit. Je ale nutné sledovat teplotu v jádře potraviny, protože zde je teplota zpravidla mnohem nižší než teplota povrchová nebo v okolním prostředí. Při teplotě 5 °C se salmonely přestávají množit. Teploty pod bodem mrazu salmonely neničí, ale při dlouhodobém skladování může dojít k jejich subletálnímu poškození.

Hraniční hodnota aktivity vody pro množení salmonel je 0,92. Salmonely však přežívají i v potravinách s nižší a_w (sušené mléko, čokoláda, koření apod.). V případě sušeného mléka bývá přežívání salmonel spojováno s technologií sprejového sušení. Pokud jsou příčinou salmonelóz sušené mléčné výrobky, nejčastější příčinou je nevhodné zacházení s rekonstituovaným produktem (např. uchovávání obnoveného mléka delší dobu při pokojové teplotě), které umožní resuscitaci a růst bakterií ve výrobku.

Rozmezí hodnot pH, při kterém se salmonely mohou množit je 3,8 – 9,5, optimum je při neutrálním pH. Snížení pH potravin organickými kyselinami je vhodným prostředkem k zamezení přežívání salmonel u potravin jako jsou například kysané mléčné výrobky nebo fermentované masné výrobky. Koncentrace soli nad 9 % působí při optimální teplotě 37 °C baktericidně.

Metody stanovení v potravinách

Stanovení salmonel v potravinách se provádí obvykle kvalitativně. Ke kultivaci se používají neselektivní pomnožovací média a dále selektivní tekuté či pevné půdy obsahující látky inhibující růst doprovodné mikroflóry (např. chlorid sodný, žlučové soli, briliantová zeleň, antibiotika), dále cukry, které salmonely štěpí a za přítomnosti indikátoru pH dochází ke změně barvy půdy v okolí kolonií. Suspektní kolonie jsou konfirmovány biochemicky a sérologicky sadou somatických (O) a bičíkových (H) antigenů, příp. i antigenů povrchového pouzdra (Vi).

Průkaz bakterií rodu Salmonella plotnovou metodou se provádí dle ČSN EN ISO 6579 (2003) a zahrnuje 4 po sobě jdoucí stupně: pomnožení v neselektivní tekuté půdě – pufrovaná peptonová voda (PPV), pomnožení ve 2 tekutých selektivních půdách – Rappaport Vassiliadis sója médium (RVS médium) a Mueller-Kauffman tetrationát novobiocin médium (MKTTn médium), vyočkování a konfirmaci. Vyočkování se provádí na dvě pevné selektivní půdy – agar s xylózou, lyzinem a deoxycholátem (XLD agar) a kteroukoli jinou selektivní půdu např. agar s fenolovou červení a brilantovou zelení (BR agar) nebo chromogenní agar pro stanovení salmonel (např. Rambach agar, IRIS Salmonella agar.

Bakterie rodu Salmonella mohou být ve vzorcích přítomny v nízkých počtech a jsou často provázeny značně vyššími počty jiných příslušníků čeledi Enterobacteriaceae nebo příslušníků jiných čeledí. Proto je nezbytné selektivní pomnožení. Kromě toho je nezbytným krokem předpomnožení, které umožňuje průkaz subletálně poškozených buněk.

V praxi jsou při průkazu salmonel v potravinách využívány také imunologické metody ELISA a ELFA , jejichž výhodou je především menší časová náročnost. Komerčně dostupné jsou také imunochromatografické detekční sety.

Pro rychlou detekci salmonel z potravin je možné použít metodu polymerázové řetězové reakce, v potravinách s nižší koncentrací salmonel je však nutné vzorky předpomnožit.

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci

Při biochemické konfirmaci se provádí následující testy: růst na TSI agaru, průkaz štěpení močoviny, průkaz lyzindekarboxylázy, průkaz β-galaktozidázy, VP test a průkaz tvorby indolu. Pro biochemickou konfirmaci je dovoleno použít komerční identifikační soupravy (např. ENTEROtest, API test).

Po biochemické identifikaci následuje sérologická konfirmace a sérotypizace, která je zaměřena na průkaz O, Vi a H antigenů aglutinační reakcí.

Při genotypové charakterizaci izolátů salmonel lze mimo různých modifikací metody PCR (např. multiplex či real-time PCR, RFLP-PCR) využít i metodu pulzní gelové elektroforézy (PFGE).