PCR – polymerázová řetězová reakce
Princip metody:
Princip PCR je založen na využití enzymu DNA-polymerásy pro opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý primer reaguje s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA.
Mnohonásobné amplifikace (tzn. namnožení DNA) je dosaženo opakováním tří základních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken.
Při denaturaci templátové DNA (obvykle při teplotě 95 °C) dochází k uvolnění vodíkových vazeb mezi bázemi komplementárních nukleotidů a k přechodu dvouřetězcové šroubovice DNA (ds) na jednořetězcovou (ss).
Při kroku hybridizace se reakční směs nejprve ochladí (teplota kolem 50 – 60 °C). Dříve než dojde ke znovuvytvoření dvouřetězcové DNA jsou na specifická místa navázány komplementární primery (tzv. annealing primerů), které zabrání vzniku původní dvoušroubovice.
Za přítomnosti DNA-polymerásy a základních stavebních kamenů DNA –nukleozidtrifosfátů (2´-deoxyribonukleozid-5´-trifosfátů, dNTP) je obvykle při teplotě 72 °C zahájen proces prodlužování primerů podle templátu (původní DNA). Tato fáze se nazývá syntéza nebo elongace a po určité době (přibližně 1 minutě) se celý proces znovu opakuje od bodu 1, a to přibližně 30krát.
Schéma – princip metody PCR, první cyklus:
|
|
Celý proces amplifikace probíhá v termocykleru – přístroji, který umožňuje nastavení cyklického střídání teplot v reakční směsi v přesně definovaných časových intervalech. K detekci namnožených PCR produktů je nejčastěji využívána elektroforetická separace v agarózovém gelu s následným obarvením v roztoku ethidium bromidu a vizualizací v UV světle.