Průkaz V. parahaemolyticus v potravinách

Princip metody:

Průkaz Vibrio parahaemolyticus vyžaduje čtyři po sobě následující stupně. Zkoušený vzorek se inokuluje do tekuté selektivní pomnožovací půdy – alkalizovaná peptonová voda s vyšším obsahem soli (ASPW), a inkubuje se aerobně při 37 °C po dobu 6 hodin (hluboko zmrazené výrobky) nebo při 41,5 °C po dobu 6 hodin (čerstvé výrobky). Kultura se přeočkuje opět do ASPW a inkubuje se aerobně při 41,5 °C po dobu 18 hodin. Následně provedeme vyočkování na dvě pevné selektivní půdy – agar s thiosulfátem, citranem, žlučí a sacharózou (TCBS) a kteroukoli jinou selektivní půdu. Inokulované misky se inkubují aerobně při 37 °C po dobu 24 hodin a zjišťuje se přítomnost suspektních kolonií V. parahaemolyticus. Následně se provede konfirmace vybraných suspektních kolonií. Výsledkem je průkaz přítomnosti či absence V. parahaemolyticus v navážce vyšetřovaného vzorku.

Postup metody:

• První pomnožení: odebereme zkušební vzorek (obvykle 25 g nebo 25 ml) a připravíme výchozí ředění, jako ředící roztok použijeme devítinásobné množství (tj. 225 ml) ASPW média. Inkubujeme aerobně v termostatu při 37 °C po dobu 6 hodin (hluboko zmrazené výrobky) nebo při 41,5 °C po dobu 6 hodin (čerstvé výrobky).

• Druhé pomnožení: přeneseme 1 ml pomnoženého vzorku do zkumavky s 10 ml ASPW média. Inkubujeme aerobně v termostatu 41,5 °C po dobu 18 hodin.

• Izolace: z druhého pomnožení provedeme vyočkování sterilní bakteriologickou kličkou na dvě selektivní půdy. Povinnou půdou je agar TCBS, druhá selektivní půda se volí podle zvyklostí laboratoře. Inokulované Petriho misky obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme aerobně v termostatu při 37 °C po dobu 24 hodin.

• Při hodnocení sledujeme nárůst suspektních kolonií V. parahaemolyticus. Pro konfirmaci vybereme náhodně z každé plotny 5 suspektních kolonií.

• Kolonie vybrané pro konfirmaci subkultivujeme vyočkováním na živný agar s vyšším obsahem soli (SNA). Konfirmace V. parahaemolyticus je založena na následujících testech: oxidáza, mikroskopické vyšetření a biochemická konfirmace.

• Na základě výsledků konfirmace potvrdíme nebo vyloučíme přítomnost V. parahaemolyticus v navážce vyšetřovaném vzorku.

Schéma – průkaz V. parahaemolyticus v potravinách:

Morfologie charakteristických kolonií:

• TSCB agar – V. parahaemolyticus roste po 24 hodinách inkubace v hladkých, zelených (sacharóza negativních) koloniích o průměru 2 – 3 mm.