MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MASA A ORGÁNŮ

 

Mikrobiologické vyšetření svaloviny a orgánů jatečných zvířat se provádí v případech podezření na patologické stavy, které by mohly ohrozit mikrobiologické parametry masa.

Odběr vzorků k vyšetření se provádí v průběhu post mortem prohlídky jatečných kusů. Základní mikrobiologické vyšetření zahrnuje testování na přítomnost bakterií rodu Salmonella spp., přítomnost anaerobních bakterií a dále se zjišťuje celková úroveň bakteriální kontaminace.

Indikace k vyšetření

  • vyloučení infekce masa patogenními nebo podmíněně patogenními mikroorganismy
  • podezření na sníženou kvalitu masa
  • patologické stavy, záněty, horečnatá onemocnění
  • porodní a poporodní komplikace
  • opožděné vykolení
  • chybění některých částí těla zvířete
  • export a import

Vzorky

Vzorky pro mikrobiologické vyšetření lze odebrat v průběhu nebo po provedení post mortem prohlídky, tedy bez vychlazení masa a orgánů. Základní vyšetřované vzorky odebírané v případě těl velkých jatečných zvířat jsou:

  • kostka svalu o hraně nejméně 8x8x8 cm z přední části těla zvířete a zadní části těla zvířete odebraná křížovým pravidlem
  • mízní uzliny, celé, neporušené, obdané okolním vazivem nebo tukem, křížově z přední a zadní části těla zvířete, celkem tedy dvě uzliny, nejvhodnější jsou:
    • ln. cervicalis superficialis (dorsalis – prasata) a
    • lnn. iliofemorales (skot) či lnn. iliaci medii (prasata)
    • celá neporušená ledvina nebo její část o délce alespoň 10 cm
    • celá neporušená slezina nebo její část o délce alespoň 10 cm
    • kostka jater o hraně 6-8 cm, případně se žlučníkem

U malých jatečných zvířat se k vyšetření odebírají celá těla. U mláďat velkých jatečných zvířat se k vyšetření odebírají celá játra.

Vzorky pro mikrobiologický rozbor se odebírají také z částí těla a orgánů, které jsou změněné.

 

Pomůcky k provedení vyšetření

  • bakteriologické kličky
  • kahan
  • opalovací pistole
  • parafín
  • pipety
  • sterilní pinzety, skalpely, nůžky
  • stojan na zkumavky
  • termostat
  • vodní lázeň
  • zkumavky
  • kultivační půdy – krevní agar s beraní krví, glukózový agar, pufrovaná peptonová voda, pomnožovací půdy dle Rappaport-Vassiliadise a Müller-Kaufmanna, XLD agar, půda s brilantovou zelení

 

Pro všechna mikrobiologická vyšetření se vzorky ke kultivaci odebírají po předchozím opálení povrchu vzorku opalovací pistolí. Povrchové opálení je potřebné pro odstranění sekundární kontaminace. Poté se vzorek v místě opálení nařízne za použití sterilních nástrojů a samotná vyšetřovaná tkáň se odebírá z hloubky vzorku.

Stanovení celkové úrovně bakteriální kontaminace = primokultivace

Cílem tohoto vyšetření je orientační zjištění úrovně bakteriální kontaminace vyšetřovaných vzorků zjištěných kultivací na pevných základních půdách a diferenciačních půdách, kde podle morfologie, pigmentace a hemolýzy vylučujeme, eventuálně izolujeme podezřelé kolonie. Při primokultivaci se používá krevní agar a půdy pro stanovení Salmonella spp.

Provedení vyšetření

Odebrané vzorky kultivujeme otiskem a následným rozočkováním pomocí bakteriální kličky. Vzorky svaloviny kultivujeme zvlášť na polovinu Petriho misky, stejně tak kultivujeme vzorky mízních uzlin. Orgány očkujeme na třetinu půdy, vystačí nám tedy jedna miska s agarovou půdou. Schéma kultivace. Při primokultivaci kultivujeme všechny vzorky na krevní agar a všechny vzorky na pevné selektivní půdy pro stanovení Salmonella spp., tedy XLD agar a druhou selektivní půdu pro salmonely.

Misky s kultivovanými vzorky se označí a umístí do termostatu dnem vzhůru. Kultivace probíhá za aerobních podmínek při 37 °C, 22 ± 2 h. Při vyhodnocení se hodnotí pigmentace, vzhled a charakter narostlých kolonií. Na krevním agaru rostou grampozitivní i gramnegativní aerobní nebo fakultativně anaerobní mikroorganismy. Za podezřelé se považují kolonie obklopené zónou alfa nebo beta hemolýzy. Takové kolonie je vhodné podrobit dalšímu testování (získání čistých kultur, gramovo barvení, rodové a druhové určení).

Posouzení poživatelnosti

Masivnost mikrobiální kontaminace, tedy množství vyrostlých kolonií na povrchu použitých pevných kultivačních médií (krevní agar), je orientačním stanovením. Denzita nárůstu se hodnotí křížky:

  • ojediněle – 1-10 kolonií, v laboratorním protokolu se označí +
  • slabě – 10-50 kolonií, laboratorním protokolu se označí ++
  • silně – nad 50 kolonií, v laboratorním protokolu se označí +++

Označení + a ++ se považuje za malé množství mikroorganismů, označení +++ za velké množství mikroorganismů.

Vzorky, u kterých byla prokázána vyšší míra bakteriální kontaminace nebo podezřelé mikroorganismy, jsou považovány za nevhodné k lidské spotřebě. Podle nálezu se pak omezuje poživatelnost nebo vyřazuje vyšetřovaný kus jatečného těla z lidské spotřeby.

Nález + se považuje za přijatelný, ++ omezení poživatelnosti, +++ nepoživatelné.

Nález v mízních uzlinách vypovídá o stavu svaloviny.

Po primokultivaci se hodnotí také nárůst kolonií suspektních jako Salmonella spp. Na XLD agaru jsou kolonie salmonel téměř průsvitné s černým středem, někdy úplně černé. Původně růžová barva agaru se v případě nárůstu salmonel ještě více zvýrazní. Na půdě s brilantovou zelení (BZ) jsou kolonie bezbarvé nebo mléčně zakalené, původně oranžovohnědá půda mění díky barevnému indikátoru barvu do výrazně růžové. Salmonely rostou při primokultivaci pouze v případech masivní kontaminace masa či orgánů tímto mikroorganismem. V drtivé většině případů je k vyšetření salmonel nutno postupovat podle normy, která vyžaduje resuscitaci subletálně poškozených buněk.

 

Stanovení Salmonella spp.

Při vyšetření vzorků na přítomnost salmonel se postupuje podle normy doporučené pro vyšetřování potravin. V případě vzorků masa a orgánů jatečných zvířat jde pouze o průkaz přítomnosti této bakterie, nikoli o stanovení jejího množství. Vyšetření vzorků masa a orgánů probíhá ve třech krocích po sobě:

  • neselektivní pomnožení zaměřené na resuscitaci subletálně poškozených buněk, provádí se v tlumivé peptonové vodě
  • selektivní pomnožení pro potlačení růstu jiných příslušníků čeledi Enterobacteriaceae, provádí se v půdách dle Rappaport-Vassiliadise se sójou (RVS) a půdě dle Müller-Kauffmanna s tetrathionanem a novobiocinem (MKTTn)
  • vyočkování a kultivace na selektivních agarových médiích, používá se půda s xylózou, lyzinem a deoxycholanem (XLD) a kterákoli jiná pevná selektivní půda, např. půda s brilantovou zelení (BZ)

Provedení vyšetření

Schéma stanovení salmonel

Posouzení poživatelnosti

Vzorky, u kterých byla prokázána přítomnost bakterií z rodu Salmonella, se považují za nevhodné pro lidskou spotřebu.

 

Stanovení anaerobních mikroorganismů

Většina běžně se vyskytujících anaerobních mikroorganismů není náročná na živiny, proto se k jejich stanovení mohou používat základní kultivační média. Pro vyšetřování vzorků masa a orgánů se používá nejčastěji glukózový agar nebo masopeptonový agar. Pro růst anaerobů je potřebné zajistit prostředí bez přístupu kyslíku. Nejjednodušším způsobem je přelití povrchu kultivačního média parafínem. Anaerobní mikroorganismy se v případě vyšetření vzorků masa a orgánů kultivují v glukózovém agaru rozplněném do zkumavek.

Provedení vyšetření

Před vlastním stanovením se zkumavky zahřejí až do rozpuštění agaru a poté se ochladí pod proudem studené tekoucí vody na teplotu přibližně 45 °C. Takto připravené půdy jsou připraveny k očkování. Vzorky svaloviny a mízních uzlin se očkují zvlášť, vzorky orgánů dohromady. Optimální je umístění vzorků až na dno zkumavky. Schéma kultivace.

Po opětovném ztuhnutí agaru se povrch převrství rozpuštěným parafinem, vrstva by měla být silná zhruba 0,5-1 cm. Naočkované zkumavky se inkubují při 37 °C 22 ± 2 h.

Posouzení poživatelnosti

Zkumavky, u kterých došlo k pomnožení anaerobních mikroorganismů, jsou po inkubaci snadno rozeznatelné. Během růstu anaerobů dochází k tvorbě plynu, který způsobí porušení celistvosti agarové půdy (potrhání) a nadzvednutí parafínové zátky.

Vzorky, u kterých byla prokázána přítomnost anaerobů, se považují za nevhodné k lidské spotřebě.