REZIDUA INHIBIČNÍCH LÁTEK

Rezidua inhibičních látek jsou definovány jako veškeré farmakologicky účinné látky, ať už účinné složky, pomocné látky nebo produkty rozkladu a jejich metabolity, které zůstávají v potravinách získaných ze zvířat, jimž byl podán daný veterinární léčivý přípravek.

Maximálním limitem reziduí se rozumí maximální koncentrace rezidua, která vzniká v důsledku používání veterinárního léčivého přípravku (vyjádřená v mg/kg nebo μg/kg čerstvé tkáně) a kterou může Společenství uznat v potravinách nebo na potravinách za legálně povolenou nebo přijatelnou. Je založen na takovém typu a množství rezidua, které nepředstavuje pro zdraví člověka žádné toxikologické riziko vyjádřené na základě přijatelné denní dávky (ADI) nebo na základě dočasné ADI využívající doplňkového bezpečnostního faktoru. Zohledňuje rovněž další významná rizika pro veřejné zdraví stejně jako hlediska potravinářské technologie.

Stanovení reziduí inhibičních látek (RIL) v mase je důležitým zdravotním i technologickým kritériem pro jeho nákup a zpracování. Rezidua inhibičních látek způsobují řadu problémů, jak u samotné suroviny, tak následně po konzumaci masa.

Negativní účinky u příjemců mohou zahrnovat:

  • alergické reakce na rezidua
  • toxický efekt reziduí při dlouhodobém příjmu
  • vznik rezistence mikroorganismů k různým antibiotikům
  • poruchy ve složení střevní mikroflóry
  • ovlivnění technologických vlastností masa, zejména narušení fermentačních procesů

Indikace k vyšetření

  • porážka nemocných zvířat (podezření na léčení, aniž by to chovatel uvedl v IPŘ)
  • podezření na nedodržení ochranné lhůty
  • export a import
  • experimentální účely – stanovení délky ochranné lhůty

Vzorky

Vzorky potřebné k vyšetření na rezidua inhibičních látek se odebírají v průběhu nebo po provedení prohlídky post mortem. Na toto vyšetření lze použít vzorky odebrané na mikrobiologické vyšetření masa a orgánů, nebo vzorky odebrat zvlášť.

Základními vyšetřovanými vzorky u velkých jatečných zvířat jsou:

  • kostka svalu o hraně nejméně 8x8x8 cm z přední a zadní části těla zvířete odebrané křížovým pravidlem
  • ledvina nebo její část o délce alespoň 10 cm
  • kostka jater o hraně 6-8 cm

 

U malých jatečných zvířat se k vyšetření odebírají celá těla. U mláďat velkých jatečných zvířat se k vyšetření odebírají celá játra. Vzorky svaloviny lze pro vyšetření na rezidua odebrat i z místa okolí vpichu.

Minimální množství vzorků (tkání) pro účely monitoringu (státem hrazené zakázky) jsou u velkých jatečných zvířat (skot, ovce, kozy, prasata, koně) následující:

  • svalovina: 500-750 g
  • játra: 500 g
  • ledviny: 500 g
  • tuk z okolí ledvin: 300 g

Vzorky nesmí pocházet od kanců a kryptorchidech jedinců.

U drůbeže (kuřecí brojleři, vyřazené nosnice, krůty, vodní drůbež), králíků a zvěře chované farmovým způsobem se odebírají vzorky

  • svalovina: 500-750 g
  • játra: 500 g

U sladkovodních ryb je odebírají pouze vzorky svaloviny o hmotnosti 750 g, případně více ryb stejného druhu od stejného chovatele.

Množství reziduí inhibičních látek v mase a orgánech jatečných zvířat lze stanovit s využitím metod fyzikálně – chemických nebo metod mikrobiologických. Fyzikálně chemické metody jsou kvalitativní i kvantitativní, lze tedy určit jak druh použité výchozí látky, tak její množství. Tyto metody kladou vyšší nároky na přístrojové vybavení laboratoře, stanovení je časově i finančně náročnější. Metody jsou proto využívány především v referenčních laboratořích. K fyzikálně chemickým metodám lze zařadit především chromatografii – plynovou i kapalinovou, metody ELISA a RIA.

Mikrobiologické metody využívané pro detekci RIL jsou pro plošný monitoring vhodnější díky své jednoduchosti, spolehlivým výsledkům i časové nenáročnosti. Jedná se o kvalitativní testy konstruované jako plotnové metody či komerčně vyráběné širokospektrální testy.Mezi používané plotnové metody patří čtyřplotnová metoda, metoda s kmenem Geobacillus stearothermophilus a metoda s kmenem Escherichia coli. Je žádoucí, aby byly použity všechny typy ploten, proto se někdy této metodě říká šestiplotnová. Mezi širokospektrální testy používané pro vyšetření tkání patří Premi test a Explorer.

Princip plotnových metod

Test se provádí jako agar difuzní test. V testovací půdě (základní živný agar) je přítomen testovací mikroorganismus, který svým růstem (případně vyklíčením spor) reaguje na přítomnost reziduí inhibičních látek. Vyšetřované vzorky se umístí na plotnu ve formě kousků tkání. V případě, že testované vzorky obsahují RIL, dochází k difuzi těchto látek do agarové půdy v okolí vzorku, což inhibuje růst testovacích mikroorganismů. Inhibice růstu se projeví vytvořením inhibiční zóny po inkubaci agarových ploten. Využitím různých druhů testovacích mikroorganismů a rozdílného pH testovacích ploten lze po vzniku inhibiční zóny uvažovat o tom, z jaké skupiny antibiotik dané reziduum pocházelo.

 

Pomůcky k provedení plotnových metod

  • opalovací pistole
  • sterilní pinzety, skalpely a nůžky
  • kultivační půdy (glukózový agar, masopeptonový živný agar s upraveným pH) s testovacími mikroorganismy
  • Používané testovací mikroorganismy:
    • Bacillus subtilis
    • Kocuria rhizophila
    • Geobacillus stearothermophillus
    • Escherichia coli
    • Přehled ploten:
      • Plotna č. 1 – Bacillus subtilis, pH 6,0
      • Plotna č. 2 – Bacillus subtilis, pH 8,0
      • Plotna č. 3 – Kocuria rhizophila, pH 8,0
      • Plotna č. 4 – Bacillus subtilis + trimetoprim, pH 7,2
      • Plotna č. 5 – Geobacillus stearothermophilus, pH 8,0
      • Plotna č. 6 – Escherichia coli, pH 8,0
      • kontrolní disky napuštěné antibiotiky
      • posuvné měřidlo

Pro všechna mikrobiologická vyšetření se vzorky ke kultivaci odebírají po předchozím opálení povrchu vzorku opalovací pistolí. Sterilními nůžkami nebo skalpelem a pinzetou se vystřihne z hloubky tkáně vzorek o velikosti 7x7x7 mm, který se položí na povrch testovací plotny. Vzorky silně mikrobiálně kontaminované nejsou vhodné k vyšetření!

Provedení vyšetření

Testovací plotny se před samotnou inokulací vzorků krátce předsuší v termostatu tak, aby byl povrch půdy suchý bez kondenzované vody. Doprostřed testovacího agaru se pomocí pinzety umístí kontrolní disk napuštěný antibiotikem. Na každou plotnu se pak kladou vzorky testovaných tkání tak, aby na testovací plotně nebyly více než 4 kusy vzorků.

Naočkované plotny se umístí na 1 hodinu do chladničky, kde při teplotách 4-7 °C probíhá difuze látek ze vzorku do agaru. Poté se plotny inkubují při teplotách optimálních pro růst testovacích mikroorganismů.

Plotny obsahující B. subtilis (č. 1, 2, 4) se inkubují při teplotě 30 °C, plotny s K. rhizophila a E. coli (č. 3, 6) se inkubují při teplotě 37 °C a plotna s G. stearothermophilus (č. 5) se inkubuje při teplotě 64 °C. Všechny plotny se inkubují 18-24 h, plotnu s G. stearothermophilus (č. 5) lze odečíst už po 5 h inkubace. Plotny se při inkubaci neobracejí dnem vzhůru.

Vyhodnocení výsledků a posouzení poživatelnosti

Plotnové metody umožňují skupinovou identifikaci inhibiční látky. Hodnotí se úplná inhibice růstu testačního kmene kolem vzorků tkání, což se projeví tak, že okolo vzorku zůstává agarová půda nezměněná, je jasná. Ve zbytku agaru dochází k vyklíčení spor testovacích mikroorganismů, případně k růstu kmene, což se projeví jako zákal nebo lze pozorovat splývající KTJ přímo v testovacím agaru. Inhibiční zóna vždy vzniká okolo kontrolního disku napuštěného antibiotikem. Pokud by kontrolní inhibiční zóna nevznikla, je to známka toho, že došlo k chybě při přípravě testovacích půd.

Velikost inhibiční zóny se měří od vnějšího okraje vzorku po vnitřní okraj inhibiční zóny. Vzorek se považuje za pozitivní, pokud je inhibiční zóna

Při použití šestiplotnové metody lze usoudit, z které skupiny antibiotik dané reziduum pochází.

Tabulka 1: Skupina antibiotik a odpovídající za vznik inhibiční zóny na jednotlivých plotnách

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V případě, že je vyšetřovaná tkáň pozitivní, posílají se vzorky do referenčních laboratoří pro další kvalitativní i kvantitativní vyšetření.

Těla jatečných zvířat s prokázanou přítomností reziduí inhibičních látek jsou nevhodná pro lidskou spotřebu. U vzorků testovaných těl malých jatečných zvířat se omezení poživatelnosti vztahuje na celou zásilku, případně šarži.

PREMI® test

Komerčně vyráběný rychlý screeningový test určený primárně pro detekci reziduí penicilinových antibiotik v mase. Senzitivita testu je 10 ppb pro penicilin G. Test pracuje na principu agarových mikrobiologických metod s využitím Geobacillus stearothermophilus jako testovacího mikroorganismu. Test je mikrozkumavkový, přítomnost reziduí antibiotik se zjišťuje po inkubaci změnou barvy agarového média. V případě, že je vzorek prostý reziduí, dochází po inkubaci zkumavek při 64 °C k vyklíčení spor testovacího mikroorganismu, jejich pomnožení a produkci kyselin. Na změnu pH reaguje barevný indikátor (bromkrezolová purpur) a výsledná barva agaru se mění z původní fialové na žlutou.

Pomůcky k provedení vyšetření

Provedení vyšetření

Vzorkem pro vyšetření je masová šťáva, která se získá stlačením kousku svaloviny v lisu na česnek, nebo jiným způsobem. Vzorky by měly být testovány ihned po příchodu do laboratoře, pokud jsou vzorky silně mikrobiálně kontaminované, nejsou pro vyšetření vhodné. Pomocí stříkačky a jednorázových špiček (součást soupravy) se nasaje 100 ± 5 µl masové šťávy a aplikuje se na povrch agaru v mikrozkumavce. Zkumavky se nechají inkubovat 20 minut při laboratorní teplotě, poté se masová šťáva slije a mikrozkumavka se několikrát propláchne demineralizovanou vodou. Takto ošetřené zkumavky se inkubují v suchých termoblocích nebo vodní lázni 3-4 hodiny při teplotě 64 °C. Posouzení změny barvy (výsledku) se provádí ve spodní třetině agaru v mikrozkumavce.

Vyhodnocení a posouzení poživatelnosti

Barva testu po inkubaci

  • fialová – výsledek pozitivní, přítomny RIL
  • žlutá – výsledek negativní, nepřítomny RIL

Pozitivní vzorky je vhodné testovat dalšími mikrobiologickými nebo fyzikálně chemickými metodami.

Těla jatečných zvířat s prokázanou přítomností reziduí inhibičních látek jsou nevhodná pro lidskou spotřebu. U vzorků testovaných těl malých jatečných zvířat se omezení poživatelnosti vztahuje na celou zásilku, případně šarži.

Legislativní podklady

  • Nařízení Rady (EHS) č. 2377/90 ze dne 26. června 1990, kterým se stanoví postup Společenství pro stanovení maximálních limitů reziduí veterinárních léčivých přípravků v potravinách živočišného původu
    • zahrnuje základní definice týkající se RIL a uvádí konkrétní hodnoty pro rezidua veterinárních léčivých přípravků a seznam komodit, ve kterých se vyšetřují
    • Zákon 166/1999ze dne 13. července 1999 o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon)
      • konkrétní informace v § 19
      • Vyhláška 291/2003ze dne 26. srpna 2003 o zákazu podávání některých látek zvířatům, jejichž produkty jsou určeny k výživě lidí, a o sledování (monitoringu) přítomnosti nepovolených látek, reziduí a látek kontaminujících, pro něž by živočišné produkty mohly být škodlivé pro zdraví lidí, u zvířat a v jejich produktech.
        • Konkrétní informace v § 1

Kromě základních legislativních pramenů vydává každoročně SVS Plán pravidelného sledování (monitorování) přítomnosti nepovolených látek, reziduí a látek kontaminujících v potravinovém řetězci, podle kterého se provádí úřední odběry a vyšetření vzorků. Počty plánovaných odběrů vzorků jsou vypočítány z celkového počtu jednotlivých druhů porážených zvířat a z celkové produkce surovin a potravin živočišného původu za posledních 12 měsíců. Vyšetřování vzorků, odebíraných podle tohoto plánu, je součástí státní kontroly zdravotní nezávadnosti krmiv a potravin živočišného původu v rámci kontroly dodržování požadavků všeobecného potravinového práva (nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) 178/2002) provozovateli potravinářských podniků. Výsledky tedy slouží především orgánům státního veterinárního dozoru. Veřejnosti jsou každoročně souhrnně prezentovány formou informačního bulletinu na oficiálních webových stránkách SVS ČR (www.svscr.cz) a průběžně formou tiskových zpráv.