Vyšetření masa na přítomnost Trichinella spp.

Humánní trichinelóza je závažné parazitární zoonotické onemocnění, které vyvolávají hlístice rodu Trichinella. U zvířat se trichinelóza klinicky neprojevuje.  K nakažení lidí i zvířat dochází po konzumaci syrového nebo nedostatečně tepelně opracovaného masa obsahujícího larvy trichinel. Dospělé larvy trichinel parazitují v tenkém střevě hostitele, kterým bývají lidé, prasata, hlodavci, medvědi, mroži, koně, další masožravá a všežravá zvířata, také někteří ptáci a plazi. Trichinella je parazit s přímým vývojovým cyklem. Po pozření kontaminovaného masa dochází během jedné hodiny vlivem trávící tekutiny v žaludku k uvolnění larev. Larvy přechází do tenkého střeva, kde pohlavně dozrávají a dorůstají na velikost 1,5 mm x 36 µm – samci a 3 mm x 36 µm – samice. V tenkém střevě larvy přežívají zhruba dva měsíce, během této doby produkují velké množství dalších larev, které migrují krevními a lymfatickými cestami do celého těla. Cílovým místem je příčně pruhovaná svalovina s určitými predilekčními místy. U prasat jsou to brániční pilíře a svalovina jazyka, následovaná žvýkacími svaly, u koní jsou největší koncentrace trichinel nalézány ve svalovině jazyka, ve žvýkacích svalech, bránici a krční svalovině. Druhy schopné vytvářet pouzdro se ve svalovině opouzdřují a zůstávají zde infekční po řadu let.

Rod Trichinella zahrnuje 12 identifikovaných genotypů, devíti z nich bylo přiděleno druhové jméno.

  • Trichinella spiralis (T-1) je rozšířena v teplých oblastech celého světa, je nejčastějším druhem napadajícím domácí prasata, divoká prasata, hlodavce, koně a jiné       masožravce.
  • Trichinella nativa (T-2) napadá masožravce v arktických a subarktických oblastech Severní Ameriky, Evropy a Asie. Vykazuje značnou rezistenci vůči mrazu.
  • Trichinella britovi (T-3) se vyskytuje převážně u volně žijících zvířat, příležitostně u domácích prasat a koní v teplých oblastech Evropy, Asie, na jihu a západě Afriky.
  • Trichinella pseudospiralis (T-4) má kosmopolitní rozšíření, byla nalezena u dravých ptáků, volně žijících masožravců, všežravců, včetně hlodavců, vačnatců v Asii, Severní       Americe, Evropě a Austrálii. Název pseudospiralis vychází z toho, že tento druh trichinel netvoří okolo larev ve svalovině kolagenové pouzdro.
  • Trichinella murrelli (T-5) je nalézána u masožravců v Severní Americe. Je málo infekční pro domácí prasata i koně, i přesto však představuje zoonotické nebezpečí.
  •  Trichinella T-6 je genotyp adaptovaný na chladné klima, nejvíce se podobá T. nativa a stejně jako T. nativa je rezistentní vůči mrazu. Vyskytuje se u koní a prasat v Severní       Americe.
  • Trichinella nelsoni (T-7) se vyskytuje u masožravých savců a příležitostně divokých prasat ve východní Africe.
  • Trichinella T-8 byla nalezena u masožravých savců v Namibii a Jižní Africe.
  •  Trichinella T-9 byla potvrzena u masožravých savců v Japonsku. Genotyp T-8 se svými vlastnostmi podobá T. britovi, genotyp T-9 T. murrelli.
  • T. papuae (T-10) stejně jako
  • T. zimbabwensis (T-11) netvoří okolo larev ve svalovině pouzdra. T-10 se vyskytuje u domácích i divokých prasat a farmově chovaných krokodýlů na Papui, Nové Guineji. T-11 napadá volně žijící i farmově chované krokodýly v Zimbabwe, Etiopii a Mozambiku, experimentálně je však vysoce infekční pro prasata a hlodavce.
  • T. patagoniensis (T-12) se svými vlastnostmi nejvíce podobá T. britovi a T. murrelli. Vykazuje určitou odolnost vůči zmražení, byla nalezena u kočkovitých šelm v Jižní Americe.

Všechny druhy trichinel mohou způsobit onemocnění člověka, ne všechny však přirozeně infikují prasata. U prasat jsou nalézány nejčastěji druhy T. spiralis, britovi, pseudospiralis a papuae, ostatní druhy a genotypy nemají u prasat větší význam.

Humánní trichinelóza je závažné, vyčerpávající onemocnění, které může končit fatálně. Dospělé larvy parazitující v tenkém střevě mohou vyvolat lehkou gastroenteritidu s nevolností, zvracením, průjmem, zvýšenou teplotou a bolestmi břicha, tyto příznaky onemocnění se projevují zhruba za 7 dní po konzumaci kontaminovaného masa. Mnohem závažnější příznaky a komplikace však vyvolávají migrující larvy a larvy lokalizované v příčně pruhované svalovině. Druhá fáze onemocnění (od druhého týdne po infekci) je doprovázena bolestmi zasažených svalů, bolestí hlavy, horečkou, otokem obličeje – zejména očních víček, bolestmi kloubů, kašlem, kožní vyrážkou apod. Ve vážných případech nastávají problémy s dýcháním, problémy s koordinací pohybu a poruchy činnosti srdce. Trichinelóza může být i smrtelná (mortalita se pohybuje mezi 3-5 %). Největší riziko nakažení představuje v současné situaci v ČR zvěřina.

Diagnostické techniky trichinelózy jsou založeny na:

  1. detekci a identifikaci parazita nebo
  2. detekci specifických protilátek

V rámci prevence onemocnění jsou jednoznačně doporučovány metody přímé detekce parazita ve svalovině potravinových zvířat. Mezi přímé metody řadíme metodu trávící a její ekvivalenty, trichinoskopické vyšetření a metodu PCR. Vnímavá potravinová zvířata musí být vyšetřena referenční metodou nebo metodami ekvivalentními tak, jak je popsáno v Nařízení komise (ES) č. 1375/2015, kterým se stanoví zvláštní předpisy pro úřední kontroly trichinel v mase, v platném znění.

 

PŘÍMÉ METODY DETEKCE

Referenční metoda – metoda vyšetření hromadných vzorků trávící metodou s použitím magnetické míchačky (trávící metoda)

Princip metody vychází z imitace vnitřního prostředí žaludku, kdy během působení trávících šťáv obsahujících pepsin a kyselinu chlorovodíkovou dochází z rozpuštění pouzder okolo larev ve svalovině a volné larvy tak mohou postoupit dále do tenkého střeva.

Senzitivita testu záleží na množství testované tkáně a místě vzorkování. Parazita lze detekovat již za 17 dní po expozici, souběžně s tím, kdy se larvy stávají infekční pro nového hostitele. Citlivost trávící metody je přibližně 3 larvy /1 g tkáně. Metoda je nejcitlivější u čerstvých vzorků, citlivost se snižuje u mraženého masa a svaloviny v rozkladu. Senzitivita testu stoupá přímo úměrně s množstvím testované tkáně, pokud tedy testujeme 5 g, zvyšuje se citlivost až na 1 larvu/1 gram. Větší množství vzorku (10 g) se vyžaduje, pokud se testují vzorky od volně žijících zvířat a koní, navíc u volně žijících zvířat nejsou dostatečně prozkoumána predilekční místa.

Vzorkování

Vzorky pro referenční metodu se odebírají systematicky v rámci veterinární prohlídky na jatkách. Při vyšetřování referenční metodou se vzorky odebírají jednotlivě z každého vyšetřovaného kusu, přičemž základní vyšetřovaná skupina vzorků má váhu 100 g. Při malém počtu vyšetřovaných zvířat (množství vzorku do 50 g) lze množství činidel v trávící tekutině snížit na polovinu. Naopak, k základní skupině lze přidat až 15 g navíc a vyšetřovat vzorky společně.

Velikost vzorku se liší podle druhu a stáří testovaných zvířat:

  • domácí prasata výkrmová (žírná) – 1 g odebraný z bráničního pilíře u přechodu do šlachovité části
  • chovné prasnice a kanci – 2 g z bráničního pilíře u přechodu do šlachovité části

Pokud brániční pilíře chybí, je třeba vzorek zdvojnásobit a odebrat jej z náhradních míst (žeberní část bránice u hrudní kosti, žvýkací sval, sval jazyka, břišní svaly), tzn. 2 g u výkrmových prasat a 4 g u chovných prasnic či kanců.

U zmrazených vzorků vepřového masa nebo z porcovaného masa je třeba k analýze odebrat vzorek příčně pruhované svaloviny o hmotnosti nejméně 5 g.

  • koně – vzorky o váze nejméně 10 g ze svalu jazyka nebo žvýkacího svalstva

Pokud tyto svaly chybí, odebere se celý vzorek z bráničního pilíře u přechodu do šlachovité části.

  • divoká prasata – vzorky o váze nejméně 10 g z přední nohy, jazyka nebo bránice.

Vzorky svaloviny určené k vyšetření je třeba zbavit veškeré pojivové a tukové tkáně, stejně tak je třeba odstranit sliznici jazyka, kterou nelze trávit. Vzorky se smíchají na množství 100 g pro každou jednotlivě vyšetřovanou skupinu. Před započetím vyšetření se vzorky pomelou na velikost 2-4 mm.

Těla jatečných zvířat (prasat, koní) se po odběru vzorků na průkaz Trichinella spp. mohou označit značkou zdravotní nezávadnosti a umístit do chladíren. Nesmí však opustit potravinářský podnik až do té doby, než laboratorní vyšetření potvrdí negativitu vyšetřených vzorků. Je také možné těla bourat v teplém stavu na nejvýše 6 částí, opět za splnění podmínky, že žádná z těchto částí neopustí potravinářský podnik dříve, než budou kusy prohlášeny za negativní. Podobně ostatní části zvířete určeného k lidské nebo zvířecí spotřebě, které obsahují příčně pruhovanou svalovinu, nesmí opustit prostory jatek dříve, než je prokázán negativní výsledek vyšetření. Živočišný odpad a VŽP neurčené pro lidskou spotřebu a neobsahující příčně pruhovanou svalovinu mohou prostory opustit předtím, než jsou k dispozici výsledky vyšetření.

Stanovení

1)    Příprava trávící tekutiny – množství trávící tekutiny záleží na množství testované tkáně. Pro vyšetření 100 g vzorku jsou potřeba 2 l trávící tekutiny složené z:

  • 2 litry pitné vody o teplotě 46-48 °C
  • 16 ml 25% HCl (nebo 11 ml 37% HCl)
  • 10 g pepsinu (1:10,000 NF/1:2500 BP/2000 FIP)

2)    Trávení vzorku – vzorky připravené k testování (nasekané, pomleté) se po částech smíchají s připravenou vodou a kyselinou chlorovodíkovou a společně se homogenizují. Po dosažení rovnoměrného rozptýlení vzorku v trávící tekutině se nakonec přidá pepsin, do kádinky se vloží magnetická míchačka a za udržování teploty okolo 47 °C a neustálého míchání se vzorek tráví přibližně 30 minut. Kádinka se přikryje aluminiovou folií a rychlost otáček se nastaví tak, aby tekutiny tvořila hluboký vír. Trávení je ukončeno v okamžiku, kdy původní vzorek je zcela natráven. Dobu trávení lze prodloužit, maximálně však na 60 minut.

3)    Sedimentace vzorku – natrávená tekutiny se přelije přes síto s oky o velikosti 180 µm do sedimentační baňky, kde se ponechá po dobu 30 minut. Uvolněné larvy sedimentují na dno sedimentační baňky. Po uplynutí potřebné doby se rychle odpustí 40 ml do malého odměrného válce a znovu ponechá stát po dobu 10 minut.

4)     Vyšetření sedimentu – horních 30 ml tekutiny se odlije nebo odsaje a zbylých 10 ml se vyšetří na Petriho misce nebo jiné vhodné nádobce při zvětšení 15-20x pod mikroskopem, stereomikroskopem nebo trichinoskopem. Při nálezu podezřelých objektů je nutno sedimenty vyšetřit při čtyřicetinásobném zvětšení. Larvy mají velikost 30 µm (šířka) x 1 mm (délka) a pokud jsou živé, vykazují čilý spirálovitý pohyb. Nález mrtvých larev (tvar písmene C) znamená rovněž pozitivitu vzorku.

Larvy lze uchovat pro druhové určení v 70-75 % etanolu, pro dlouhodobé uchování v 95 % etanolu.

Maso zvířat, u kterého byly nalezeny larvy trichinel je vyloučeno z lidské spotřeby. V případě použití trávící metody jsou vždy vyšetřeny směsné vzorky od více zvířat naráz, proto je potřeba z celé pozitivní skupiny dohledat pozitivní kus/y a opakovat odběr vzorků. V tomto případě se využívají většinou náhradní místa pro odběr, velikost vzorku od jednoho kusu je 20 g. Skupiny po 100 g a opakované odběry 20 g svaloviny se vyšetřují tak dlouho, dokud se neodhalí pozitivní kus/y. V případě koní nebo divokých prasat je váha dalších vzorků 50 g.

Trávící metoda vyšetření má několik alternativ, které jsou popsány v Nařízení ES 1375/2015, princip metod – trávení však zůstává stejný.

Mezi přímé metody lze dále zařadit trichinoskopické vyšetření. Při trichinoskopickém vyšetření dochází k přímému vyšetření vzorků příčně pruhované svaloviny roztlačené mezi dvěma silnými skly (kompresorium) pod stereomikroskopem nebo mikroskopem. V pozitivním případě lze pozorovat zapouzdřené/neopouzdřené larvy trichinel. Tato metoda má mnohem nižší senzitivitu než metoda trávící, navíc vždy záleží na velikosti a místě odběru vzorku. Z těchto důvodů je povolena pouze pro vyšetřování vzorků svaloviny z volně žijících zvířat, jejichž těla jsou určena konečným spotřebitelům.

Při vyšetření divokých prasat se vzorky odebírají ze šesti míst. Velikost vzorku z jednoho místa je ± 1 g. Pokud nejsou k odběru určité svaly k dispozici, odeberou se čtyři vzorky z dostupných míst. Základní odběrová místa:

  • oba brániční pilíře
  • svalovina čelisti
  • svalovina dolní kýty
  • mezižeberní svalovina
  • jazyk

Vzorky se nastříhají na malé kousky a naplní se jimi kompresorium, což jsou dvě silná skla rozdělená na 28 polí, které lze sešroubovat k sobě. Stlačení/sešroubováním skel dojde ke kompresi vzorků, svalovinu je pak možné prohlížet pod mikroskopem a hledat opouzdřené nebo neopouzdřené larvy trichinel.

Poslední možností přímé detekce parazita je metoda polymerázové řetězové reakce. Tato metoda prokáže přítomnost specifické DNA, proto je využívána zejména pro druhovou identifikaci a určení genotypu v referenčních laboratořích. Nehodí se pro rutinní používání u potravinových zvířat, ačkoli její senzitivita je vysoká.

NEPŘÍMÉ METODY testování zahrnují metody sérologické, které prokazují přítomnost specifických protilátek. Metody zahrnují imunofluorescenci, western blot, imunoelektrotransfer blot, imunohistochemické reakce a ELISA metodu, která jediná je standardizována. ELISA metoda se hodí pro testování přítomnosti specifických protilátek u skupin zvířat jako nástroj epizootologického sledování, podává informace o pozitivitě/negativitě populací, ale nehodí se pro individuální testování jednotlivých kusů. Citlivost ELISA metody je u prasat stanovena na méně než 1larvu/100 g tkáně. Hlavní nevýhodou a nemožností používat ELISA metodu u potravinových zvířat je zpožděná produkce specifických protilátek, které jsou detekovatelné až za 3-5 týdnů po expozici. V praxi to znamená, že i pozitivní zvířata vychází v testu jako negativní. Vytvořené protilátky zůstávají detekovatelné po řadu měsíců u prasat, u koní jejich titr postupně klesá, ačkoli ve svalovině mohou být infekce schopné larvy. Dynamika protilátek v průběhu infekce a po infekci není dostatečně známa u divokých zvířat. Vzorkem pro ELISA metodu je krevní sérum, krev nebo meat juice (masová šťáva) získaná z živých nebo poražených/ulovených/uhynulých zvířat.

Všechny druhy trichinel lze spolehlivě inaktivovat teplotou nad 70 °C. V některých případech je možné maso, které nebylo vyšetřeno referenční metodou, podrobit zmrazení podle stanovených podmínek (viz Příloha II, Nařízení ES 1375/2015). Zmrazení přežívají některé druhy trichinel, zejména T. nativa a genotyp T-6, určitou rezistenci vykazuje také T. britovi, proto se na tuto metodu ošetření nelze plně spolehnout. Žádná ze zemí EU metodu zmrazení namísto plošného testování masa potravinových zvířat nevyužívá, z důvodu značné ekonomické náročnosti vybavení mrazíren. Plošné testování referenční metodou se nemusí provádět u prasat určených na výkrm a pocházejících z hospodářství prostého trichinel, nebo regionu, kde je riziko výskytu trichinel zanedbatelné. Splnění obou statusů klade značné požadavky na chovatele a v současné době splňují tyto požadavky pouze Dánsko a Belgie.