Průkaz:
Průkaz bakterií čeledi
Enterobacteriaceae je založen na použití
selekčních činidel potlačujících růst grampozitivních bakterií (např. žlučové soli, krystalová violeť, briliantová zeleň, atd.), dále
indikátorů zkvašování glukózy (indikátor pH, tvorba plynu) a provedení
oxidázového testu. Inkubace probíhá při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Vlastní stanovení se provádí buď s resuscitací vzorku v tekutém médiu nebo bez resuscitace, podle očekávaného počtu mikroorganismů se volí metoda nejvýše pravděpodobného počtu nebo plotnová metoda.
Princip:
Určený objem tekutého vzorku, výchozí suspenze u ostatních výrobků a jejich desetinásobných ředění se zalévá agarovou živnou půdou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen
agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučovými solemi a glukózou (VČŽG agar, angl. VRBG agar). Naočkované plotny se inkubují aerobně při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně se provede subkultivace vybraných charakteristických kolonií, jejich biochemická konfirmace a úprava počtu kolonií na miskách podle výsledku konfirmace. Z počtu identifikovaných suspektních kolonií vyrostlých na vybraných miskách se vypočte počet bakterií čeledi
Enterobacteriaceae v 1 ml nebo 1 g vzorku.
Alternativní metoda: provádíme-li stanovení bakterií čeledi
Enterobacteriaceae z technologických důvodů (chceme zachytit i psychrotrofní kmeny), volíme pro inkubaci alternativní teplotu 30 °C.
Po ukončení inkubace spočítáme charakteristické kolonie narostlé na každé misce. Pro hodnocení použijeme misky obsahující ne více než 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Po spočítání kolonií vybereme z každé plotny 5 charakteristických kolonií pro subkultivaci a biochemickou konfirmaci.
Morfologie charakteristických kolonií:
Po 24 hodinách kultivace mají kolonie narostlé na VČŽG agaru následující morfologii:
- uvnitř půdy – kolonie červené či fialově červené barvy o průměru 0,5-2 mm, někdy obklopené červenou zónou precipitované žluče;
- na povrchu půdy – kolonie červené či fialově červené barvy o průměru 1-3 mm, kolonie mají často světlejší bezbarvý okraj, většina kmenů tvoří v půdě pod koloniemi růžový precipitát.
Konfirmace
Subkultivaci provedeme rozočkováním vybrané kolonie na masopeptonový agar (MPA) a po inkubaci 24 hodin při 37 °C vybereme z každé plotny jednu dobře izolovanou kolonii pro biochemickou konfirmaci.
Biochemická konfirmace spočívá v provedení oxidázového testu (např. OXI test proužky) a zkoušky na fermentaci glukózy s tvorbou plynu.