Imunomagnetická separace (IMS) je metoda založená na principu vazby bakteriálních nebo jiných buněk na magnetické částice s imobilizovanými specifickými protilátkami. Vzniklý komplex je možné separovat ze suspenze pomocí vnějšího magnetického pole. Tato specifická separační technika umožňuje významné selektivní zakoncentrování cílových buněk. Díky tomu lze IMS úspěšně využít jako náhradu kroku selektivního pomnožení při kultivačním stanovení významných patogenních mikroorganismů, např. salmonel,
Listeria monocytogenes nebo
E. coli O157.
Postup:
- Potřebné množství mikrozkumavek Eppendorf vložíme do magnetického separátoru Dynal MPC-M z něhož vyjmeme magnetický pás. Zkumavky označíme na víčko.
- Resuspendujeme Dynabeads magnetické částice anti-E.coli O157 a do každé zkumavky napipetujeme 20 µl suspenze.
- Do každé zkumavky přidáme 1 ml vzorku (pokaždé novou pipetou), zkumavky uzavřeme.
- Obsah zkumavek promícháme (jemným vortexováním nebo převracením), zkumavky vložíme do separátoru a za stálého šetrného třepání inkubujeme při laboratorní teplotě po dobu 10 minut.
- Po ukončení inkubace vložíme do separátoru magnetický pás. Imunomagnetické částice separujeme mírným otáčením stojánku po dobu 3 minut (vizuální kontrola separovaného komplexu).
- Zkumavky otevřeme a opatrně odstraníme supernatant ze zkumavky, popř. i z víčka (na každý vzorek nová pipeta). Pozor na magnetické částice na stěně zkumavky!
- Ze separátoru vyjmeme magnetický pás a do každé zkumavky přidáme 1 ml promývacího fosfátového pufru s Tweenem. Zkumavky uzavřeme a separátor se zkumavkami několikrát převrátíme.
- Do separátoru vložíme magnetický pás a separujeme imunomagnetické částice po dobu 3 minut. Promývání suspenze opakujeme ještě 2x.
- Po odstranění posledního promývacího roztoku vyjmeme ze separátoru magnetický pás a do každé zkumavky přidáme 50 µl promývacího pufru. Zkumavky uzavřeme a obsah promícháme jemným vortexováním.
- Kličkou vyočkujeme obsah mikrozkumavky na povrch selektivně diagnostického média (Sorbitol MacConkey agar s BCIG).
- Misky inkubujeme aerobně při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Charakteristické kolonie E. coli O157 jsou na této půdě bezbarvé o velikosti asi 1 mm.
;){kind=link}