Metoda průkazu Listeria monocytogenes

Průkaz:

Průkaz Listeria monocytogenes zahrnuje 4 po sobě jdoucí stupně: primární pomnožení, sekundární pomnožení, vyočkování a konfirmaci. Bakterie rodu Listeria mohou být ve vzorcích přítomny v nízkých počtech a jsou často provázeny značne vyššími počty příslušníku jiných rodů a proto je nezbytné selektivní pomnožení. Dále je nutné prokázat i subletálně poškozené buňky, což umožňuje pomnožení v tekuté selektivní půdě s poloviční koncentrací inhibičních složek.

Princip:

Zkoušený vzorek se inokuluje do tekuté selektivní půdy pro primární pomnožení – poloviční bujón podle Frasera(1/2 FB médium), a inkubuje se aerobně při 30 °C po dobu 24 hodin. Získaná kultura se preočkuje do tekuté selektivní půdy pro sekundární pomnožení – bujón podle Frasera (FB médium), a inkubuje se aerobně při 37 °C po dobu 24-48 hodin. Z primárního i sekundárního pomnožení se provádí vyočkování na dvě pevné selektivní půdy – agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho (ALOA agar) a kteroukoli jinou selektivní půdu např. PALCAM agar. Naočkované misky se inkubují aerobně při 37 °C po dobu 24-48 hodin a zjištuje se přítomnost suspektních kolonií L. monocytogenes. Následně se provede konfirmace vybraných suspektních kolonií. Výsledkem je průkaz přítomnosti či absence L. monocytogenes v navážce vyšetřovaného vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

ALOA agar – L. monocytogenes roste po 24 hodinách inkubace v modrozelených koloniích obklopených širokou neprůhlednou kruhovou zónou precipitace (haló); L. ivanovii roste pomaleji, zóna precipitace je méně výrazná.

PALCAM agar – po 24 hodinách jsou kolonie L. monocytogenes drobné šedozelené nebo olivově zelené barvy o průmeru 1,5-2 mm, mnohdy s černým stredem a obklopeny černou kruhovou zónou; po 48 hodinách mají kolonie vkleslý střed.

Rapid`L.mono - L. monocytogenes roste po 24 hodinách inkubace v modrých koloniích bez změny barvy média, L. ivanovii v modrozelených koloniích se žlutou okolní zónou, kolonie L. innocua jsou bílé a kolonie L. welshimeri a L. seeligeri bílé se žlutým okolím.

Konfirmace:

Pro konfirmaci vybereme z každé plotny 5 suspektních kolonií.
Kolonie vybrané pro konfirmaci subkultivujeme vyočkováním na agar s tryptonem, sójovým peptonem a kvasnicným extraktem (TSYE agar). Konfirmace L. monocytogenes je založena na následujících testech: průkaz hemolýzy, využívání cukrů (rhamnózy, xylózy) a CAMP test. Na základě výsledku konfirmace potvrdíme nebo vyloučíme přítomnost L. monocytogenes ve 25 g nebo 25 ml vyšetrovaného vzorku.