Metoda stanovení počtu Listeria monocytogenes

Průkaz:

Stanovení počtu Listeria monocytogenes zahrnuje 3 po sobě jdoucí stupně: resuscitaci, vyočkování a konfirmaci. Nejnižší počet L. monocytogenes stanovitelný touto metodou je 10 KTJ v 1 ml tekutého vzorku nebo 100 KTJ v 1 g ostatních vzorků.

Princip:

Zkoušený vzorek se inokuluje do tekuté resuscitační půdy – pufrovaná peptonová voda (PPV médium) nebo poloviční bujón podle Frasera (1/2 FB médium). Resuscitace probíhá aerobně při teplotě 20 °C po dobu 1 hodiny. Následně se určený objem výchozí suspenze vzorku či desetinásobných ředení roztírá na agarovou živnou pudou v Petriho miskách. Jako arbitrážní půda je určen agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho(ALOA agar). Naočkované plotny se inkubují aerobně při 37 °C, po dobu 24-48 hodin. Poté se provede konfirmace vybraných charakteristických kolonií a úprava počtu kolonií na miskách podle výsledku konfirmace. Z počtu potvrzených suspektních kolonií se vypočte počet L. monocytogenes v 1 ml nebo 1 g vzorku.

Morfologie charakteristických kolonií:

ALOA agar – L. monocytogenes roste po 24 hodinách inkubace v modrozelených koloniích obklopených širokou neprůhlednou kruhovou zónou precipitace (haló); L. ivanovii roste pomaleji, zóna precipitace je méně výrazná.

Rapid`L.mono - L. monocytogenes roste po 24 hodinách inkubace v modrých koloniích bez změny barvy média, L. ivanovii v modrozelených koloniích se žlutou okolní zónou, kolonie L. innocua jsou bílé a kolonie L. welshimeri a L. seeligeri bílé se žlutým okolím.

Konfirmace:

Pro konfirmaci vybereme z každé plotny 5 suspektních kolonií.
Kolonie vybrané pro konfirmaci subkultivujeme vyočkováním na agar s tryptonem, sójovým peptonem a kvasnicným extraktem (TSYE agar). Konfirmace L. monocytogenes je založena na následujících testech: průkaz hemolýzy, využívání cukrů (rhamnózy, xylózy) a CAMP test. Na základě výsledku konfirmace potvrdíme nebo vyloučíme přítomnost L. monocytogenes v 1 g nebo 1 ml vyšetrovaného vzorku.