INFEKČNÍ ONEMOCNĚNÍ

Viry

Virus je mikroorganismus, který je tvořen jednou nebo několika molekulami DNA nebo RNA, které jsou obaleny zpravidla bílkovinnou složkou. Na rozdíl od bakterií, k množení vyžadují přítomnost hostitelské buňky. Vlastní reprodukce mimo buňky nejsou schopny. Přítomnost nukleové kyseliny umožňuje reakci organismu a tvorbu imunitní odpovědi. Velikost virů se pohybuje od 20-300 nm. Mezi nejmenší známé viry patří např. parvoviry (parvus – latinsky malý). Až 300 nm mohou mít naopak viry neštovic – poxviry. Kromě velikosti se viry od sebe liší i svým tvarem, který může být kulovitý, vláknitý nebo tyčinkovitý. Nejdůležitější součástí viru je nukleová kyselina, která je nositelkou genetické informace a tvoří genom viru. Dle typu nukleové kyseliny rozlišujeme DNA nebo RNA viry. 

Genetická informace uložená ve formě RNA je pro viry jedinečná. RNA viry vykazují vyšší stupeň mutací, což představuje evoluční výhodu, kdy RNA viry snadněji unikají obranným mechanismům organismu. 

Nukleová kyselina virového genomu je obalena proteinovou ochrannou vrstvou – kapsidou. Tato schránka je zpravidla kubická (dvacetistěn) nebo helikoidální (spirálovitá). Nukleová kyselina, která je obalena kapsidou se nazývá nukleokapsida. Viry, které jsou tvořeny pouze touto nukleokapsidou se označují jako viry neobalené. Většina virů má na svém povrchu ještě membránu, která je obdobná cytoplazmatické membráně buněk. Je složená z fosfolipidů, proteinů, glykopeptidů a polysacharidů.

Takové to obalené viry jsou pak oproti virům neobaleným odolnější vůči dezinfekčním prostředkům. Naopak viry neobalené bývají odolnější vůči éteru, tukovým rozpouštědlům a jsou relativně odolné i k vlivům zevního prostředí.

Základní strukturní a infekční virovou částicí je virion, který je tvořen obalenou nebo neobalenou nukleokapsidou.

Množení viru

Díky svému způsobu replikace je řadíme mezi obligátně intracelulární patogeny. Průběh množení má několik na sebe navazujících fází. Samotný reprodukční cyklus zahajuje fáze adsorpce, kdy dochází k navázání viru na povrch vnímavé buňky.  Pro adsorpci je nezbytná přítomnost receptorů, na které se mohou viriony navázat. Po adsorpci následuje fáze penetrace, kdy dochází k průniku viru do buňky. Způsoby průniku se liší v závislosti na druzích virů. Nejčastěji dochází k průniku pomocí pinocytózy (vchlípení cytoplazmatické membrány dovnitř buňky, typ endocytózy).  Další fází je dekapsidace, kdy dochází k rozrušení povrchu viru a obnažení genomu prostřednictvím buněčných proteolytických enzymů. Následuje fáze eklipsy, kdy je zahájena vlastní reprodukce viru. Dochází k předání genetické informace viru genomu buňky. Poté následuje reprodukce virové DNA nebo RNA. Pro svou reprodukci využívají transkripční a translační aparát vnímavé hostitelské buňky. Ve fázi maturace dochází ke konečnému dotvoření genomu virionů – DNA nebo RNA včetně obalu virů.  Posledním krokem je uvolnění viru z buňky.

Viriony opouštějí buňku různými způsoby. Viriony se uvolňují pučením nebo přestupem přes mezibuněčné kanálky.  U cytopatogenních virů dochází k uvolnění virionů rozpadem buňky (lýza). Uvolněné viriony pak mohou napadat další buňky. Takový to proces množení označujeme jako lytický cyklus. V případě, že virus se aktivně v buňce nemnoží a začleňuje se pouze do genomu hostitelské buňky, hovoříme o lyzogenním cyklu. S takovým to mechanismem se setkáváme u virů čeledi Retroviridae, kde RNA je přepisována reverzní transkriptázou do DNA, která je integrována jako provirus do genomu hostitelské buňky.

Klasifikace 

v rámci taxonomického systému virů je založena na typu nukleové kyseliny (RNA nebo DNA), počtu vláken (jednovláknitá nebo dvouvláknitá), charakteristické genomu a strategii replikace.

Viry obsahující jednovláknitou DNA – ssDNA viry

Viry obsahující dvojvláknitou DNA – dsDNA viry

Viry obsahující jednovláknitou RNA – ssRNA viry

Diagnostika virů

Průkaz původců onemocnění je možný přímým a nepřímým způsobem. Hlavním cílem je, aby diagnostika byla rychlá, jednoduchá, dostatečně citlivá, specifická a rovněž byla ekonomicky nenákladná.

Přímý průkaz viru

je nutný při podezření na velmi nebezpečnou nákazu (např. SLAK, mor prasat). 

Prokazována je přímo přítomnost viru nebo jeho částí – virových antigenů. 

Nepřímý průkaz

je za běžných okolností dotačující. Jsou prokazovány specifické protilátky.   

Většina virů je schopna přežívat mimo buňku po různě dlouhou dobu v závislosti na teplotě, pH prostředí, světelném záření, aktivitě vody apod. Vzorky pro vyšetření tedy musí být chráněny, což zpravidla zajišťuje vhodné transportní médium (fyziologický roztok s různými protektivními složkami).  Vzorky pro virologické vyšetření se uchovávají zpravidla při + 4 °C v případě, že jsou zpracovány do 48 hodin.

Odběr vzorkumusí být proveden ze správného místa a ve vhodný čas. Ideálně by měl být proveden odběr v době manifestace nespecifických klinických příznaků. V prodromálním stádiu infekce jsou totiž agens přítomny v maximálním množství. V pozdějších fázích onemocnění množství v krvi klesá a může úplně vymizet, což diagnostiku z krve může zastřít a zkomplikovat.

Materiál k virologickému vyšetření

Místo odběru se odvíjí od předpokládané příčiny samotného onemocnění v závislosti na suspektní diagnóze. Primárním místem vstupu u virů bývají epiteliální povrchy. Nejčastěji odebíraným vzorkem bývají výtěry, a to z nosu nebo nosohltanu, případně aspirát z nosní dutiny nebo z hrtanu. U střevních infekcí bývá častým vzorkem trus, případně výtěr z rekta. Kromě výtěrů lze získat sekrety rovněž sondou nebo výplachem. Výtěry lze získávat rovněž z pohlavních cest nebo oka. Při změnách na kůži se často provádí stěry z kožních lézí.

Přímý průkaz viru

Metody přímé diagnostiky virů zahrnují:

1) mikroskopie (obtížná pro malou velikost virů)

2) izolace viru (kultivace viru)

 - buněčné kultury, kuřecí embrya, pokusná zvířata

3) konečná identifikace viru (na základě analýzy DNA nebo RNA) – metody molekulární biologie – PCR

4) určení dalších potřebných vlastností viru (virulence, průkaz antigenu)

 

DETEKCE VIRU ELEKTRONOVÝM MIKROSKOPEM

Mezi největší výhody elektronových mikroskopů patří velmi velké zvětšení – řádově až 1 000 000, což umožňuje detailně pozorovat virovou strukturu. Mezi nevýhody patří, že preparáty musí být umístěny ve vakuu a v případě TEM musí být vzorky velice tenké.
Pro zvýšení citlivosti a konečnou identifikaci viru lze využít imunoelektronové mikroskopie. Metoda se využívá hlavně u obtížně rozlišitelných virů, jako jsou enteroviry.

Elektronová mikroskopie umožňuje na rozdíl od jiných metod přímo vizualizovat virus, který je pak možné identifikovat na základě morfologie. Ve veterinární medicíně se tato metoda začala používat koncem 60. let. Na rozdíl od optického mikroskopu, kde se využívají skleněné čočky a viditelné světlo, v elektronové mikroskopii jsou přítomny čočky elektromagnetické a místo fotonů je využíván svazek elektronů. Lidské oko je schopné rozlišit detaily s minimální velikostí (rozlišovací schopnost) 0.1 mm. Velikost virů se pohybuje od 20-300 nm. U optického mikroskopu je jeho maximální rozlišovací schopnost 200 nm v závislosti na typu mikroskopu. Tuto rozlišovací schopnost nelze zvyšovat např. stupňováním okulárového zvětšení, neboť je omezena vlnovou délkou světla. Optický mikroskop tak k diagnostice virů využít nelze. V případě elektronových mikroskopů je vlnová délka podstatně kratší než u viditelného světla a jelikož je rozlišovací schopnost úměrná vlnové délce použitého záření má elektronový mikroskop mnohem vyšší rozlišovací schopnost – 0,2 nm. Mimo jiné má také mnohem vyšší efektivní zvětšení (až 1 000 000×) oproti optickým mikroskopům.

Pro diagnostiku v elektronové mikroskopii se zpravidla využívá vezikulární tekutina, kožní léze, nosohltanový sekret, sliny, slzy, tekutina z bioptického materiálu nebo tkáňových kultur. Dalším klinickým materiálem využívaným v elektronové mikroskopii bývá moč, krevní  sérum,  mozkomíšní  mok,  stolice,  bradavice,  bioptický  a autoptický  materiál,  tkáňové  kultury  a  chorioalantois. 

Rozlišují se dva základní typy elektronových mikroskopů:

Rastrovací (skenovací) elektronový mikroskop SEM funguje tím způsobem, že na vzorek dopadá svazek elektronů, které se následně odráží (emitace) a převádí na viditelný obraz. Lze jej využít k detailnímu zobrazení povrchových struktur viru.

Transmisní elektronový mikroskop TEM na rozdíl od SEM umožňuje průchod svazku elektronů vzorkem a při vizualizaci nám tak zobrazí vnitřní struktury viru.


KULTIVACE VIRŮ

Jelikož replikace virů probíhá pouze v živých buňkách, přímý průkaz virů kultivací nelze provádět na živných agarových půdách jak je tomu v případě bakterií. Pro kultivaci viru lze využít buněčné kultury, kuřecí embrya nebo laboratorní zvířata. Nevýhodou virové kultivace je její časová náročnost a také obtížný výběr správného kultivačního systému.

V současné době je nutné v pokusech uplatňovat koncept 3R. Cílem je omezit zbytečné utrpení zvířat, a to tím, že jsou nahrazeny metodami in vitro (replacement). V případě, že to není možné, využívají se alespoň pro pokusy živočichové s nižším stupněm vývoje. Dalším bodem je omezení počtu prováděných pokusů (reduction), kdy by měly být použity v pokusu co nejmenší počet zvířat. Počet zvířat by měl být ale minimálně takový, aby bylo možné získat validní výsledky. Pokud není možné se při pokusu vyhnout využití laboratorních zvířat, je potřeba provést pokus tak, aby zvířata co nejméně trpěla (refinement).

Uplatňováním konceptu 3R jsou tak experimentální zvířata využívána i pro kultivaci virů jen velmi omezeně např. při diagnostice vztekliny.

Kultivace virů může být prováděna také na kuřecích embryích. V současnosti ustupuje tato metoda buněčným kulturám, ale v případě diagnostiky některých aviárních virů nebo virů chřipky má stále velký význam.

K diagnostice se využívají oplozená vajíčka, která pocházejí ze SPF (specific pathogen free) chovů. Jedná se o chovy, kde jsou zvířata chována s definovanou mikrobiální mikroflórou.  Do oplozeného vejce se aplikuje vyšetřovaná tekutina (inokulum). Způsoby inokulace se liší dle typu viru a jeho účinků. (inokulace do žloutkového vaku, amniového vaku, alantoidního vaku nebo inokulace na chorionalantoidní membránu). Embrya jsou pak inkubována několik dní. Následně jsou oplozená vejce prosvěcována a vejce neoplozené nebo s mrtvým embryem jsou vyřazována. Výsledkem kultivace jsou kuřecí embrya s namnoženým virem, kterým jsme tato embrya původně inukulovali. Namnožený virus lze využít k diagnostice nebo např. k výrobě vakcín.

Buněčné kultury představují v současné době zlatý standard v diagnostice virů. Ačkoliv se již dnes využívají velmi rychlé metody prokazující viry ve vyšetřovaném materiálu, pro přímý průkaz viru mají stále velký význam.  V diagnostice virů se využívají tyto druhy buněčných kultur.

Primární buněčné kultury se získávají enzymatickým rozvolněním původní tkáně. Jedná se o směs různých typů buněk, které jsou diploidní. Jejich nevýhodou je krátká životnost. Z tohoto důvodu je nutné pravidelné pasážování, kdy buňky, které tvoří jednu vrstvu, podléhají po několika dnech degenerativním změnám. Je nutné je přemístit do nové nádoby, kde budou opětovně ve vhodné koncentraci. Tímto způsobem se nastartuje nový cyklus dělení a proliferace buněk v nádobě.  Více než jednou pasážované kultury označujeme jako sekundární buněčné kultury. Pasážování lze provádět nejvíce 30-50 x (1 rok), pak dochází k selekci určitých typů buněk, což je pak nežádoucí pro kultivaci virů. Z hlediska pasážování jsou tak výhodné buněčné linie, které lze pasážovat neomezeně. Jejich plošnému využití brání skutečnost, že je nelze využít ke kultivaci u všech druhu vírů. Jedná se o heteroploidní buňky získané selekcí z primárních buněčných kultur ovlivněných mutageny nebo získané přímo kultivací buněk nádorů.  Specifické je využití orgánových kultur, které přežívají in vitro při zachování své původní struktury. Udržování a zakládání je ale náročné, a proto se využívají jen ve zvláštních případech.

PCR

Polymerázová řetězová reakce byla zavedena v roce 1983 Kary Mullis (zisk Nobelovy ceny).  Tato metoda umožňuje přímý průkaz nukleové kyseliny s vysokou specifitou a citlivostí. Vysoká citlivost této metody je zároveň i velkou nevýhodou kvůli riziku kontaminace a zisku falešně pozitivních výsledků. PCR je založena na zmnožení (amplifikace) úseku DNA do takového množství, které je pak možné vhodnou metodou detekovat. Úseky DNA, které se mají namnožit (amplifikovat), musí být ohraničeny na začátku a na konci tzv. primery (krátkými oligonukleotidy DNA). Ke kopírování DNA se využívá DNA-polymeráza. PCR probíhá v zařízení zvaném termocykler, ve kterém probíhají 3 opakující se kroky:

  1. Denaturace – teplota 950C, dochází k rozvolnění dvoušroubovice DNA na 2 jednořetězcové šroubovice.
  2. Hybridizace- 50-600C, dochází k navázání specifických primerů na úsek, který má být amplifikován protisměrně na obou vláknech
  3. Syntéza nového vlákna- 720C- prodlužování nového vlákna podle templátu pomoci DNA polymerázy

Celý proces se asi 30 x opakuje a trvá asi 2 – 3 h.

Amplifikovaná DNA je následně rozdělena při gelové elektroforéze podle své velikosti. K vizualizaci dochází barvením např. pomocí ethidium bromidu.  Po obarvení se gel umístí pod UV světlo, kde ethidium bromid oranžově fluoreskuje. Velikost PCR produktu je v určitém velikostním rozmezí a udává se v párech bazí (bp). K odhadu velikostí DNA produktů se používá DNA marker s fragmenty o známé velikosti.

Existuje několik modifikací klasické PCR:

Multiplex-PCR

Umožňuje detekci více genů současně. Podle počtu požadovaných PCR produktů obsahuje master mix a příslušný počet párů primerů.

Real-time PCR (qPCR)

Je schopna detekovat každý produkt PCR v reálném čase, nikoliv až po skončení. Pro stanovení využívá sledování fluorescenčního signálu, který je vysílaný sondami navázanými specificky nebo nespecificky na amplifikované úseky. Metoda je jednodušší a rychlejší než klasická PCR. Velkou výhodou metody real-time PCR je možnost kvantifikace množství templátu.

RT-PCR = polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí

Umožňuje amplifikaci segmentu RNA, což nachází uplatnění u diagnostiky RNA virů.

Řetězec RNA je nejprve přepsán do cDNA pomocí enzymu reverzní transkriptázy a poté probíhá již celý cyklus reakcí jako běžná PCR.


HEMAGLUTINAČNÍ TEST

Tato metoda přímé diagnostiky virů je založena na schopnosti některých virů aglutinovat erytrocyty.

Příkladem virů, které jsou schopny hemaglutinace jsou viry chřipky nebo parvoviry. Pokud jsou aglutinační viry přítomny, dochází k tvorbě aglutinátu ve formě zrnitého povlaku. Je-li vyšetřovaný vzorek negativní, erytrocyty sedimentují na dno.

Nepřímý průkaz viru

Nepřímá diagnostika virů je založena na průkazu protilátek.  Většinou se k průkazu protilátek využívá krevním sérum, proto se nepřímé metody označují jako serologické. Nepřímá diagnostika je založena na sledování koncentrace protilátek za delší časový úsek (2-3 týdny).  Odebírají se proto vždy párové vzorky, a to z období akutních klinických příznaků (počátek onemocnění) a z období rekonvalescence. Pro posouzení stádia onemocnění je důležité odlišení protilátek typu IgM (časná akutní infekce) a IgG (již proběhlá infekce). Pro nepřímou diagnostiku lze využít celou řadu testů.

HEMAGLUTINAČNÍ INHIBIČNÍ TEST

Tato metoda nepřímého průkazu virů je založena na schopnosti některých specifických antivirových protilátek inhibovat hemaglutinační reakci. 

Hemaglutinace je schopna celá řada virů. HIT se využívá při diagnostice parainfluenzy – 3 nebo parvovirózy prasat. Reakce může být komplikována přítomností virových inhibitorů, proto je nutné před samotným vyšetřením krevní sérum tepelně inaktivovat. Pokud jsou specifické antivirové protilátky přítomny, dochází k inhibici aglutinace, což se projeví sedimentací erytrocytů. Nejsou-li protilátky přítomny, erytrocyty nám aglutinují. K diagnostice antivirových protilátek se využívá referenční kmen viru schopný erytrocyty aglutinovat.

VIRUS NEUTRALIZAČNÍ TEST (VNT)

Podstatou je schopnost specifické protilátky neutralizovat virus. Neutralizační schopnosti se prokazují na laboratorních zvířatech, kuřecích embryích nebo nejčastěji na tkáňových kulturách.

Pokud jsou specifické protilátky v krevním séru přítomny, dochází u viru ke ztrátě schopnosti hostitelskou buňku infikovat a způsobovat u ní cytopatický efekt (CPE).  Tato metoda se využívá při diagnostice původců těchto onemocnění: Aujezskyho choroba, SLAK, IBR, BVD-MD.

IMUNOPEROXIDÁZOVÝ TEST (IPA)

Je založen na kvantitativním stanovení přítomnosti protilátek ve vyšetřovaném séru proti virovému antigenu, který je fixován v buněčné kultuře v jamkách mikrotitračních destiček. 

Přítomnost protilátek je indikována tvorbou hnědočerveného zabarvení v cytoplazmě buněk. Intenzita zabarvení v různých ředěních séra odpovídá množství přítomných protilátek. Výsledek je udáván v „titrech“. K průkazu se využívá konjugát: antidruhové protilátky + peroxidáza.

Přímý a nepřímý průkaz viru

IMUNOFLUORESCENČNÍ TEST

IF umožňuje kvantitativní i kvalitativní stanovení antigenů nebo protilátek.

Přímá imunofluorescence umožňuje průkaz viru na buněčných kulturách nebo v otiskových preparátech. K provedení testu je nutný konjugát, což je antivirová protilátka, která je označená fluorescenčním barvivem: fluorescein-izothiokyanát  FITC Po ozáření toto barvivo vyzařuje světlezelené záření. V pozitivním preparátu se konjugát nevymývá a zůstává navázán na antigen. Při pozorování pod fluorescenčním mikroskopem lze tak pozorovat inkluze světle zelené barvy.

Nepřímá imunofluorescence umožňuje průkaz specifických protilátek. Vzorky sér jsou inkubovány se známým antigenem, který je fixován na podložním skle. Jsou-li specifické protilátky přítomny, dojde k vytvoření imunokomplexů, na které se pak v druhém kroku mohou navázat fluoresceinem značené protilátky. Preparát je rovněž prohlížen ve fluorescenčním mikroskopu.


ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

Tato metoda umožňuje kvalitativní nebo semikvantitativní stanovení a patří mezi nejpoužívanější imunoenzymatickou metodu. Lze ji využít k detekci antigenů, ale častěji k průkazu protilátek (nepřímá ELISA).

Metoda provedení je obdobná u detekce virů i protilátek.

Do této imunoenzymatické reakce vstupují:

-          Ag, Ab: detekované/známé

-          konjugát- Ab proti proti druhově specifickým Ab s navázaným enzymem: křenová peroxidáza nebo alk. fosfatáza

-          substrát – reakcí s enzymem mění barvu nebo reaguje s chromogenem

Při detekci protilátek je vyšetřované sérum napipetované do jamek mikrotitrační destičky, kde je na stěnách navázán známý antigen. Protilátky, které se nenaváží na tento antigen, jsou vymyty promytím jamek. Následují přidání konjugátu, který se naváže na imunokomplexy, pokud jsou přítomny. V opačném případě se taktéž vymývá další promytím jamek. Vazbu konjugátu na imunokomplexy pak prokazujeme přidáním substrátu, který reakcí s enzymem konjugátu vytvoří barevnou reakci, a tu pak můžeme v jamkách detekovat.

Pozitivní výsledek: zbarvení jednotlivých jamek dle charakteru substrátu (modrá barva se po přidání stop roztoku (kyselina sírová) změní na žlutou).

Negativní výsledek: jamky zůstanou beze změny barvy (konjugáty i substrát jsou vymyty).

Při detekci virů probíhá imunoenzymatická metoda na stejném principu. Detekované virové antigeny se mohou navázat na protilátky, které jsou přítomny na stěnách jamek mikrotitrační destičky. Dále je stejným způsobem přidán konjugát a substrát. Vyšetřovaným materiálem pro detekci virů mohou být všechny tělní tekutiny, kde předpokládáme přítomnost viru.

Barevné změny v jamkách lze pozorovat pouhým okem nebo pomocí spektrofotometru.

Od doby vzniku této metody existuje její celá řada modifikací.  Výše byla popsána klasická sendvičová ELISA. Dalším typem může být kompetitivní ELISA, kdy známe množství značeného antigenu soutěží o vazebná místa na protilátkách (limitovaný počet) s neznámým množstvím vyšetřovaného antigenu. Volné primární protilátky se vážou na imobilizovaný antigen a jsou detekovány enzymaticky značenými sekundárními protilátkami. Nakonec je přidán chromogenní substrát. Koncentrace detekovaného antigenu je nepřímo úměrná intenzitě barevné reakce.

Na trhu je přítomna celá řada komerčních souprav na bázi ELISA. V praxi malých zvířat se používají snap testy pro průkaz celé řady onemocnění (parvoviróza psů, virová leukémie koček, virová imunodeficience koček atd.). Tyto testy poskytují výsledky během několika minut a jsou pro rychlou diagnostiku dostatečně specifické.

RIA

Radioimmuniassay

Na rozdíl od klasické ELISY jsou protilátky nebo antigeny značeny radioaktivním izotopem, zejména jódem. Nevýhodou této metody je práce s radioizotopy a náklady spojené s diagnostikou. Využití této metody u diagnostiky těchto závažných onemocnění: infekční anemie u koní, enzootická leukóza skotu, maedi-visna, bluetongue.

IMUNOBLOT (WESTERN BLOT)

Tato metoda umožňuje detekci viru s vyšší specifitou a citlivostí než ELISA. Pro průběh reakce je nutná vysoká koncentrace viru, proto je nutné využít předmnožení viru na → buněčných kulturách. Metodu lze využít i pro detekci protilátek.

Virus je nejprve detergentem (dodecylsulfátsodný) rozbit na jednotlivé strukturální proteiny, kterou jsou následně naneseny do polyakrylmidového gelu a rozděleny v elektrickém poli dle molekulové hmotnosti – elektroforéza → proteiny vytvoří proužky. Gel se přiloží na nitrocelulosovou membránu a pomocí blotovacího zařízení dojde působením elektrického proudu k přenosu proteinů z gelu na povrch membrány → vznik kopie. Membrána se inkubuje s kontrolním pozitivním sérem a následně s konjugátem. Celá reakce je pak vizualizována reakcí enzymu s příslušným substrátem a chromogenem. 

 



ÚVODNÍ STRÁNKA

INFEKČNÍ ONEMOCNĚNÍ

Úvod

Imunita

Průběh infekce

Priony

Viry

Bakterie

Dermatomykózy
a systémové mykózy



Ke stažení