Molekulární biologie

Izolace DNA a PCR

Izolace DNA

1. k buněčnému lyzátu v mikrozkumavce (vzorek z minulého týdne) přidejte 200 µl 96% ethanolu
2. uzavřete mikrozkumavku a obsah důkladně promíchejte opakovaným převrácením mikrozkumavky
3. vezměte kolonku se sběrnou zkumavkou a víčko kolonky popište fixem
4. přelijte celý obsah z mikrozkumavky do kolonky
5. centrifugujte 1 min při 10000 otáčkách
6. vložte kolonku do nové sběrné zkumavky (původní sběrnou zkumavku vyhoďte)
7. do kolonky napipetujte (novou špičkou) 500 µl promývacího roztoku 1
8. centrifugujte 1 min při 10000 otáčkách
9. vložte kolonku do nové sběrné zkumavky (původní sběrnou zkumavku vyhoďte)
10. do kolonky napipetujte (novou špičkou) 500 µl promývacího roztoku 2
11. centrifugujte 3 min při 13000 otáčkách
12. vložte kolonku do nové mikrozkumavky (1,5 ml) popsané fixem (původní sběrnou zkumavku vyhoďte)
13. napipetujte doprostřed kolonky 100 µl elučního roztoku
14. inkubujte 1 min při pokojové teplotě
15. centrifugujte 1,5 min při 13000 otáčkách (nastavit 2 minuty, po 1,5 minutě vypnout)
16. odstraňte kolonku (vyhoďte ji do odpadní nádoby) a uzavřete mikrozkumavku, která obsahuje izolovanou DNA

Příprava PCR

1. každá pracovní skupina si do mikrozkumavky (1,5 ml) připraví společnou PCR směs dle počtu vzorků (n) s rezervou (n+1):
   Směs pro jeden vzorek:
   • 10 µl - PCR master mix (směs nukleotidů dNTP, DNA polymerázy a Mg2+ iontů)
   • 0,2 µl - primer PP (TCTGGATCGCTAAATCCTTT)
   • 0,2 µl - primer P8 (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG)
   • 7,6 µl - voda pro PCR
2. napipetujte (novou špičkou) 18 µl PCR směsi do PCR mikrozkumavky (0,2 ml) označené fixem
3. napipetujte (špičkou s filtrem) 2 µl izolované DNA
4. uzavřete PCR mikrozkumavku, vložte ji do termocykleru a spusťte program
5. po dokončení programu bude PCR produkt uchován v lednici

Program PCR amplifikace

Počáteční denaturace DNA	94 °C	1 min 30 sec
Nasedání primerů (annealing)	49 °C	45 sec	30 cyklů
Syntéza komplementárního řetězce DNA (extenze)	72 °C	1 min
Denaturace DNA	94 °C	1 min
Dosyntetizování řetězců DNA (finální extenze)	72 °C	10 min

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.