Molekulární biologie

Izolace DNA

Izolace DNA je prvním krokem většiny molekulárně biologických technik.

Materiál pro izolaci DNA

• viry, jednotlivé buňky prokaryot nebo tkáně a orgány eukaryot
• tělní tekutiny (krev, plodová voda, sliny..), vlasy, peří, různé tkáně a orgány (sval, játra, mozek...)
• čerstvý, zamražený, v parafinu

Princip

1. rozrušení buněk nebo virových kapsidů působením enzymů (lysozym, celuláza) a/nebo detergentů (dodecylsulfát sodný)
2. odstranění kontaminant pomocí enzymů (proteináza, RNAáza)
3. vlastní extrakce DNA - nejčastěji je používaná fenol–chloroformová extrakce

Fenol-chloroformové extrakce

Fenol - organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK (proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze). Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází. Centrifugací je oddělena spodní organická fáze (tvořená fenolem), mezifáze (tvořená denaturovanými proteiny a zbytky buněk) a horní vodná fáze (rozpuštěna DNA). DNA je následně vysrážena etanolem, centrifugací získaný sediment obsahující DNA je rozpuštěn ve vhodném roztoku (např. ve vodě).

K izolaci DNA ze vzorku krve či tkáně je možné použit komerčně dodávané izolační soupravy (kity), které výrazně zjednodušují a urychlují postup získání DNA.

Izolační souprava obsahující promývací roztoky, enzymy, kolonky.

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.