Molekulární biologie

RFLP – restrikční reakce

RFLP (restriction fragment length polymorphism, polymorfismus délky štěpných fragmentů) je metoda, jejíž podstatou je enzymatické štěpení molekul DNA ve specifickém štěpném (restrikčním) místě enzymem, který se nazývá restrikční endonukleáza.

Princip

Každý typ restrikční endonukleázy štěpí cílovou DNA v různých místech, v závislosti na sekvenci DNA. Po rozdělení vzniklých fragmentů pomocí gelové elektroforézy lze na základě velikosti a počtu fragmentů sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy. Polymorfizmy v délkách restrikčních fragmentů jsou způsobeny přestavbami (např. inzercemi, delecemi a substitucemi bazí) ve studované sekvenci, které způsobí změnu počtu restrikčních míst.

Obr.: Příklad restrikční endonukleázy HaeIII a jejího štěpného místa

Průběh

• příprava reakční směsi (produkt PCR a specifická restrikční endonukleáza v určitém vhodném poměru)
• inkubace 37 °C 1h
• analýza štěpných fragmentů DNA na agarózovém gelu a vyhodnocení výsledků

Využití

Tato metoda může být využita např. k určení pohlaví u ptáků (bude prakticky prováděno na cvičeních), určení otcovství (test paternity), v kriminalistice k identifikaci osob, studiu polymorfismu a příbuznosti jedinců, druhů (př. studium příbuznosti člověka a ostatních primátů), porovnání virulence, kmenů nebo serotypů různých původců infekčních onemocnění.

Obr.: Určení otcovství na základě metody RFLP: DNA je izolovaná např. z buněk bukální sliznice a využita k amplifikaci specifické sekvence. Produkt amplifikace (amplikon) je následně rozštěpen enzymem a výsledné fragmenty jsou separovány gelovou elektroforézou. Výsledné fragmenty lze využít k vyloučení nebo potvrzení otcovství.

O zavedení metody se zasloužil Alec Jeffreys

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.