Molekulární biologie

Příprava tkáně k izolaci DNA

Princip

Izolace DNA se provádí pomocí izolační soupravy založené na principu adsorpce DNA na silikát. Vyšetřovaný materiál (ptačí krev či tkáň) je lyzován pomocí lyzačního pufru (obsahuje detergenty, které rozpouští membrány a denaturuje bílkoviny), enzymu proteinázy K (štěpí bílkoviny včetně histonů vázajících se na DNA) a enzymu RNázy A (rozkládá RNA). Buněčný lyzát se přenese na izolační kolonku, jejíž součásti je silikátový povrch (SiO2 – sklo). V přítomnosti chaotropních solí (součást lyzačního pufru) adheruje DNA na silikát. Kolonka s DNA vázanou na silikát je promyta a DNA následně uvolněna pomocí elučního pufru.

Zásady práce

• každý student zpracovává vlastní vzorek a pracuje v pracovní skupině, která má k dispozici sadu automatických pipet
• u pipet lze nastavit požadovaný objem - pozor na přetočení pipety mimo dané rozmezí
• k zabránění kontaminace vzorku a chemikálií se pro jednotlivé kroky používá vždy nová špička
• k zabránění kontaminace pipet se pro práci s DNA používá špička s filtrem
• k zajištění přesného objemu je třeba důkladně nasadit špičku na pipetu
• požadovaný objem se získá stlačením pipety do druhé polohy a ponořením špičky pipety do nasávané tekutiny, povolením stlačení, přenesením požadovaného objemu a stlačením pipety do první polohy
• homogenizace vzorku se provádí ve zkumavce tzv. propipetováním tj. po přidání určité chemikálie do zkumavky třikrát opakovaně nasát směs do špičky a vytlačit
• mikrozkumavky je třeba označit číslem skupiny a pořadovým číslem studenta ve skupině

Postup přípravy buněčného lyzátu

1. krev: z čerstvé nebo rozmražené krve napipetujte (použijte špičku s filtrem) 10 µl do mikrozkumavky (1,5 ml) označené fixem
   tkáň: vypreparujte kousek tkáně o velikosti maximálně dvou špendlíkových hlaviček a přeneste do mikrozkumavky (1,5 ml) označené fixem
2. novou špičkou připipetujte 20 µl proteinázy K
3. novou špičkou připipetujte 20 µl RNázy A
4. uzavřete mikrozkumavku, rukou protřepejte a nechte inkubovat při pokojové teplotě 2 minuty
5. novou špičkou připipetujte 200 µl lyzačního pufru
6. uzavřete mikrozkumavku, protřepejte a vložte do termobloku (vodní lázně) předehřátého na 55°C
7. krev: inkubujte 10 min
   tkáň: inkubujte 6 -18 hod
8. buněčný lyzát se uchová do příštího týdne při pokojové teplotě

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.