Molekulární biologie

Restrikční reakce

Princip

K určení pohlaví u ptáků se využívá gen CHD (Chromo-Helicase-DNA binding gene), který kóduje protein, jež reguluje aktivaci transkripce na úrovni chromatinu. Tento gen je u ptáků lokalizován na pohlavních chromozomech.

• Samčí pohlaví je u ptáků homogametické s pohlavními chromozomy ZZ.
• Samičí pohlaví je heterogametické s pohlavními chromozomy ZW.

Pomocí PCR je namnožena DNA odpovídající části genu na chromozomu W (CHD-W) a na chromozomu Z (CHD-Z). PCR produkt je štěpen pomocí restrikční endonukleázy (restriktázy) Hae III (izolované z bakterie Haemophilus aegyptius) v restrikčním místě:
5'-GG↓CC-3'
3'-CC↑GG-5'

PCR produkt genu CHD-Z toto místo obsahuje, proto dojde působením enzymu k odštěpení fragmentu DNA, zatímco PCR produkt genu CHD-W se enzymem neštěpí. Fragmenty jsou separovány pomocí gelové elektroforézy, vizualizovány pod UV zářením a vyhodnoceny.

Postup

1. Napipetujte 1,2 µl směsi restriktázy Hae III a aktivačního pufru do nové označené PCR zkumavky (0,2 ml).
2. Napipetujte (novou špičkou s filtrem) 10 µl PCR produktu.
3. Vložte do termocykleru při teplotě 37°C na 45 min.

Gelová elektroforéza

Princip

Gelová elektroforéza slouží pro separaci různě dlouhých fragmentů DNA. Principem gelové elektroforézy je pohyb záporně nabitých molekul DNA v elektrickém poli směrem k anodě. Elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná velikosti DNA. Elektroforéza se provádí ve vhodném nosiči, nejčastěji v gelu tvořeném agarózou či polyakrylamidem. Ve cvičení bude použita agaróza.
Agarózový gel se připravuje v různé hustotě (udávané v % práškové agarózy). Agaróza se rozpouští v pufru, který je také obsažen v elektroforetické vaně jako elektrolyt. Ve cvičení bude použit TBE pufr obsahující Tris. kyselinu boritou a EDTA. Vzorky se nanáší do jamek v gelu, které byly vytvořeny pomocí tzv. hřebínku.
Pro odhad velikosti pozorovaných DNA fragmentů se do jedné jamky gelu nanáší tzv. velikostní marker (standard, DNA ladder/žebřík) o definované velikosti jednotlivých fragmentů.
Zatížení DNA (klesne do jamky v gelu) a migrace DNA v gelu jsou zajištěny přidáním tzv. nanášecího neboli vkládacího pufru, který je tmavě zbarvený a je tak umožněna kontrola vložení PCR produktu do příslušné jamky a také migrace v gelu.
Pro vizualizaci DNA se používá značení barvivem, které váže DNA, např. ethidiumbromid nebo barvivo typu SYBR Green (SYBR Save Stain). Na cvičení bude použit SYBR Green.

Postup

Příprava 1,5% agarózového gelu:
Připraví se jeden agar pro všechny studenty ve cvičebně.

1. Do baňky typu Erlen odvažte 1,5 g agarózy.
2. Skleněným válcem odměřte 100 ml TBE pufru, přidejte do baňky kroužením promíchejte
3. Dejte baňku do mikrovlnné trouby a vařte při teplotě nastavené na maximální ohřev po dobu 2 minut (jakmile začne obsah kádinky bublat, přerušte ohřev a promíchejte obsah kádinky v ruce s nasazenou rukavicí).
4. Po 2 minutách ohřevu vyjměte baňku z mikrovlnné trouby a opatrně ji ochlaďte pod tekoucí vodou na teplotu 60 °C (teplota, kdy několik sekund udržíme kádinku přiloženou ke hřbetu ruky).
5. Napipetujte (novou špičkou) 10 µl SYBR Save stain (10.000x koncentrovaný roztok) a v ruce promíchejte.
6. Připravte si nalévací vanu a přelijte do ni rozehřátý agar z baňky do výšky minimálně 8 mm.
7. Do vany vložte hřebínek a špičkou od pipety odstraňte případné bubliny v gelu.
8. Agar ztuhne asi po 30 minutách.

Horizontální gelová elektroforéza:

1. Po ztuhnutí gelu, vyjměte hřebínek a zalijte vanu TBE pufrem, tak aby byl celý gel ponořený.
2. Do jamky v gelu naneste (novou špičkou) opatrně 11 µl vzorku tj. PCR produktu po restrikční analýze (je třeba manipulovat s pipetou opatrně ať neprotrhnete gel). Každý nanáší svůj vzorek.
3. Do jedné z jamek v gelu (nejlépe do prostřední) naneste 3 µl velikostního markeru.
4. Do poslední jamky v gelu naneste 10 µl směsného vzorku PCR produktu (směsný vzorek PCR produktu připravíte smícháním všech vzorků ve cvičebně).
5. Zapojte elektroforetickou vanu do zdroje a pusťte elektrický proud při konstantním napětí 120 V po dobu 25 minut.
6. Po ukončení elektroforézy přemístěte gel na UV-transluminátor a pod UV zářením odečtěte výsledek. V rámci bezpečnosti je třeba pozorovat gel přes plastový kryt.

Vyhodnocení

U samičího pohlaví: (ZW) se na gelu objeví 2 pruhy (bandy). Jeden větší, který odpovídá neštěpenému CHD-W (o stejné velikosti jako neštěpený PCR produkt) a druhý menší asi o 50 bp (párů bazí).

U samčího pohlaví: dojde ke štěpení CHD-Z a na gelu se objeví jeden pruh o menší velikosti.

Sekvenátor a sekvenování DNA

Než proběhne restrikční reakce (nebo gelová elektroforéza) navštivte Laboratoř sekvenční analýzy na Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat, kde se seznámíte s osmikapilárovým automatickým sekvenátorem (Beckman Coulter CEQ 8000), který slouží ke stanovení sekvence DNA na principu separace fragmentů DNA syntetizovaných terminační enzymovou Sangerovou metodou.

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.