Molekulární biologie

Gelová elektroforéza

Gelová elektroforéza patří k nejpoužívanějším separačním technikám sloužícím k analýze nukleových kyselin a proteinů.

Princip

Principem metody je pohyb záporně nabitých molekul DNA (hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny) v elektrickém poli směrem k anodě. Pomocí gelové elektroforézy můžeme separovat (oddělovat) molekuly DNA na základě rozdílných rychlostí pohybu molekul DNA v gelu, které jsou nepřímo úměrné velikosti molekuly DNA.

Elektroforéza se provádí na vhodném nosiči, nejčastěji v gelu tvořeném agarózou či polyakrylamidem (ve cvičení bude použita agaróza). Gel je tvořen složitou sítí polymerních molekul s póry, jimiž se molekuly DNA pohybují různou rychlostí v závislosti na velikosti (malé fragmenty se pohybují rychleji, tj. doputují na gelu dál).

Agarózový gel se připravuje v různé hustotě (udávané v % práškové agarózy). Agaróza se rozpouští v pufru, který je také obsažen v elektroforetické vaně jako elektrolyt (ve cvičení bude použit TBE pufr obsahující Tris, kyselinu boritou a EDTA).

Vzorky se nanáší do jamek v gelu, které byly vytvořeny pomocí tzv. hřebínku. Zatížení DNA (DNA klesne do jamky v gelu) a migrace DNA v gelu jsou zajištěny přidáním tzv. nanášecího neboli vkládacího pufru, který je tmavě zbarvený a je tak umožněna kontrola vložení PCR produktu do příslušné jamky a také migrace v gelu.

Pro odhad velikosti pozorovaných DNA fragmentů se do jedné jamky gelu nanáší tzv. velikostní marker (hmotnostní standard, DNA ladder = žebřík) o definované velikosti jednotlivých fragmentů (např. 100 bp ladder – viz obr.).

Po proběhnutí elektroforézy je třeba separované fragmenty DNA zviditelnit. Pro vizualizaci DNA se používá značení barvivem, které se váže na DNA, např. ethidiumbromid nebo SYBR Green (na cvičení bude použit SYBR Green) a v UV záření v přístroji zvaném UV transluminátor zviditelní fragmenty DNA. Pro detekci fragmentů DNA lze použít radioaktivní značení, nebo hybridizaci se značenou sondou (krátkým oligonukleotidem, který se komplementárně váže k hledané sekvenci). Rozdělené molekuly DNA lze také ve funkční formě izolovat z gelu.

Průběh

• příprava gelu z práškové agarózy a TBE pufru (obsahuje Tris. kyselinu boritou a EDTA). Do gelu se přidává ethidiumbromid nebo barvivo typu SYBR Green, které slouží k následné vizualizaci DNA v UV transluminátoru
• ke vzorku se přidá nanášecí/vkládací pufr, který zatíží DNA (klesne do jamky v gelu) a zároveň umožňuje kontrolu nanášení vzorků a migraci DNA v gelu
• nanášení vzorků do jamek v gelu vytvořených pomoci tzv. hřebínku
• pro odhad velikosti DNA fragmentů se do jedné jamky gelu nanáší tzv. velikostní marker (standard, DNA ladder/žebřík) o definované velikosti jednotlivých fragmentů
• připojení elektroforetické vany ke zdroji a spuštění elektroforézy při konstantním napětí
• přemístění gelu na UV-transluminátor a odečtení výsledků pod UV zářením

V roce 1948 byl Nobelovou cenou oceněn švédský chemik Arne Tiselius, který ve 30. letech minulého století postavil aparaturu separující proteiny krevního séra na základě jejich elektroforetických mobilit.

Obr: Agaróza a další pomůcky k přípravě gelu, vaření gelu v mikrovlnné troubě, nanášení vzorku na gel, elektroforéza, odečtení výsledků pod UV zářením

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.