Sekvenování DNA

Enzymová Sangerova metoda

foto

Autorem této metody
je Frederik Sanger

Sekvenování (sekvencování) DNA slouží ke stanovení pořadí (sekvence) nukleotidů v molekule DNA. Nejpoužívanější metodou pro stanovení sekvence DNA je enzymová (Sangerova) metoda, která využívá modifikovanou tzv. asymetrickou PCR k syntéze kopií DNA. Tato modifikovaná PCR využívá na rozdíl od „klasické“ PCR pouze jeden primer. Amplifikace PCR produktu tedy probíhá pouze na jednom řetězci DNA, na který se tento primer specificky váže a kopie molekul DNA nepřibývají exponenciální řadou.

Kromě deoxynukleosidtrifosfátů (dNTP) jsou do PCR reakce použity i dideoxynukleosidtrifosfáty (ddNTP), které postrádají hydroxylovou skupinu na 3’-konci (obr.), na kterou by se mohl navázat další nukleotid v nově vznikajícím řetězci. Tyto ddNTP tedy slouží jako terminátory syntézy.

Dříve se samotná syntéza DNA pomocí PCR prováděla odděleně ve čtyřech vzorcích, přičemž každý z nich obsahoval jiný dideoxynukleosidtrifosfát (A, T, G, nebo C).

obr.

Chemická struktura dideoxynukleosidtrifosfátu a princip terminace syntézy nově vznikajícího řetězce DNA po začlenění dideoxynukleosidtrifosfátu do nově vznikajícího řetězce DNA.

Reakční směs

  • templátová DNA
  • 1 primer připojující se k místu na molekule DNA, od něhož chceme stanovovat sekvenci
  • dNTP (deoxynukleosidtrifosfáty) v nadbytku (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
  • ddNTP (dideoxynukleosidtrifosfáty) v malém množství (jeden ze čtyř ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
  • DNA polymeráza

obr.

Výsledkem sekvenování je směs různě dlouhých sekvencí DNA, které začínají primerem a končí určitým dideoxynukleotidem. Pomocí gelové elektroforézy lze fragmenty DNA rozdělit podle velikosti a přečíst tak pořadí nukleotidů v sekvenci DNA.


obr.

Automatické sekvenování

ilustrační foto

Automatické sekvenování DNA je variantou enzymatického sekvenování DNA. Syntéza DNA probíhá v jedné PCR reakci, kdy každý ddNTP je značen jinou fluorescenční značkou. Vzniklé PCR produkty (různě dlouhé úseky jednořetězcové DNA lišící se o jeden nukleotid) jsou tak označeny jinou fluorescenční značkou podle toho jakým ddNTP jsou zakončeny.

K následnému stanovení sekvence DNA (pořadí nukleotidů) se využívá genetický analyzátor – „sekvenátor“. Detekce PCR produktů probíhá během kapilární elektroforézy pomocí laserového detektoru napojeného na počítač. Elektroforéza probíhá v tenké kapiláře naplněné gelem. Kapilárou prochází různě dlouhé PCR produkty v závislosti na jejich velikosti (stejný princip jako u gelové elektroforézy). Laser zachycuje fluorescenci ddNTP navázaných na jednotlivé PCR produkty a následně dochází ke stanovení pořadí nukleotidů (viz obr. – pořadí nukleotidů s barevným rozlišením).

Využití

ilustrační foto

Sekvenování DNA má řadu aplikací v medicíně, vědě a dalších oblastech. Sekvenují se celé genomy, případně jenom některé části, které mají pro daný obor význam.

Fylogenetika – studium fylogeneze organizmů. Zpravidla se sekvenuje DNA, která kóduje ribozomální RNA.

Medicína – využití v diagnostice chorob a časnému zjištění náchylnosti jedince k určitým nemocem (rakovina, kardiovaskulární onemocnění) a v neposlední řadě také možnost využití v genové terapii.

Antropologie – využívá srovnávání DNA ke zjišťování migrací lidských ras (zejména podle mitochondriální DNA a Y-chromozomální DNA).

Forenzní věda a kriminalistika – testování paternity, stanovení viny či neviny v případě podezření z trestné činnosti.

Zemědělství – tvorba geneticky modifikovaných plodin (GMO).

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.

 
Logo OPVK

OPVK

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Palackého 1/3, 612 42 Brno

tel.: +420 54156 1111
IČ 62157124