Biologie a genetika
pro bakaláře

Metody molekulární biologie

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE je vědní disciplína zabývající se studiem buněčných biologických procesů na molekulární úrovni. Princip fungování některých biologických jevů je odhalitelný pouze studiem jejich molekulární podstaty. Molekulární biologie studuje strukturu biomakromolekul (DNA, RNA a proteinů), jejich vzájemné interakce a regulace jejich funkcí ve vztahu k funkcím a vlastnostem buňky. Molekulární biologie tak na jedné straně souvisí s biologií buňky, na straně druhé s biochemií a genetikou. Tento dynamicky se rozvíjející obor integruje ve svém přístupu hlediska biologická, chemická i fyzikální. Metody molekulární biologie zahrnují např. fyzikální a chemické separační a charakterizační metody, jako jsou chromatografie, elektroforéza, elektronová mikroskopie a spektroskopie. Molekulárně biologické metody jsou široce využívané nejen v základním a aplikovaném genetickém výzkumu nebo v genovém inženýrství, ale i v archeologii, zoologii, botanice, klinické medicínské diagnostice, kriminalistice nebo v soudním lékařství. K hlavním metodickým přístupům molekulární biologie patří purifikace a separace nukleových kyselin, amplifikace nukleových kyselin, různé způsoby manipulace s nukleovými kyselinami, sekvenování DNA a dále pak různé metody analýzy genové exprese (studium transkripce a translace). V následující části kapitoly jsou vysvětleny principy nejpoužívanějších molekulárně biologických metod spolu s příklady jejich možného využití.

IZOLACE DNA – je prvním krokem většiny molekulárně biologických technik. Materiálem pro izolaci DNA mohou být jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek), tkáně a orgány eukaryot, které jsou nejdříve homogenizovány, nebo například virové částice. Izolace DNA zahrnuje 3 základní kroky:

1. Rozrušení buněk nebo virových kapsidů působením enzymů (lysozym, celulázy) a/nebo detergentů (dodecylsulfát sodný).
2. Odstranění kontaminant pomocí enzymů (proteináza, RNAáza).
3. Vlastní extrakce DNA – nejčastěji je používaná fenol–chloroformová extrakce, kdy buněčný lyzát je promíchán se směsí fenolu a chloroformu. Fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK. Proteiny jsou hydrofobní a zůstávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. Centrifugací je oddělena spodní organická fáze, tvořená fenolem, mezifáze, tvořená denaturovanými proteiny a zbytky buněk, a horní vodná fáze, v níž je rozpuštěna DNA. DNA je následně vysrážena etanolem, precipitát je shromážděn centrifugací a získaný sediment je rozpuštěn ve vhodném roztoku (např. ve vodě). K izolaci DNA ze vzorku krve či tkáně je možné použít komerčně dodávané izolační soupravy (kity), které výrazně zjednodušují a urychlují postup získání DNA.

PCR (polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce) je metoda sloužící k mnohonásobnému zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro. PCR zavedl v roce 1983 Kary Mullis (za objev této metody dostal Nobelovu cenu). Princip syntézy DNA touto metodou je podobný replikaci: kopie úseku DNA jsou syntetizovány pomocí enzymu DNA-polymerázy podle templátu ve formě jednořetězcové DNA na principu komplementarity bází. K zahájení reakce je zapotřebí dvou primerů (čti prajmrů) – chemicky syntetizovaných krátkých oligonukleotidů, které se připojují ke komplementárním úsekům protilehlých řetězců DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. Pomocí primerů je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. Jako templáty pro syntézu slouží oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci.

Reakční směs pro PCR:

• templátová DNA – může být izolována z různých mikroorganizmů, bioptických vzorků, stěrů, z buněk z tkáňových kultur, z tělních tekutin
• 2 primery (každý komplementární k jednomu řetězci DNA)
• dNTP (deoxyribonukleosidtrifosfáty)
• termostabilní DNA polymeráza (např. Taq polymeráza získaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus žijící v horkých pramenech)

(dNTP a DNA polymeráza bývají součástí tzv. master mixu)

Reakční směs pro PCR se napipetuje do malé PCR zkumavky, která se vloží do speciálního přístroje termocykleru (čti termosajkleru), kde probíhají cyklicky se opakující kroky za různých teplot.

Průběh PCR:

1. počáteční denaturace DNA (separace řetězců) (94 °C, 2-5 min)
Vlastní řetězová reakce: 2. denaturace (separace řetězců) (94 – 95 °C, 20 – 45 s) 3. připojení (nasedání) primerů (55 – 65 °C, 30 – 90 s) 4. polymerační reakce (72 °C, 45 – 90 s) (prodlužování řetězců pomocí DNA-polymerázy, která syntetizuje komplementární řetězce DNA z volných nukleotidů, nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus)	tyto kroky se cyklicky opakují (25-30 cyklů)
5. závěrečná extenze (72 °C, 5 min) (dosyntetizování případně nedosyntetizovaných řetězců)

Výhodou PCR je, že vyžaduje minimální množství DNA (teoreticky stačí 1 molekula DNA). Touto metodou lze získat 2ⁿ-1 kopií, kdy n je počet cyklů. Z jedné molekuly DNA lze tedy například získat po proběhnutí 30 amplifikačních cyklů víc než 10⁹ kopií.

*PCR (polymerázová – používá se enzym DNA polymeráza, řetězová reakce – počet kopií DNA roste během jednotlivých cyklů řetězovou řadou – 2, 4, 8, 16, 32...).

Výsledný produkt PCR (amplifikovaný úsek DNA) můžeme analyzovat např. stanovením velikosti produktu gelovou elektroforézou, štěpením restrikčními enzymy a posouzením vznikajících restrikčních fragmentů (RFLP), hybridizací se značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku nebo stanovením sekvence DNA (sekvenování). Variantou PCR umožňující syntézu cDNA podle RNA templátu je reverzní PCR (RT-PCR) využívající enzymu reverzní transkriptázy.

Využití PCR:

PCR má mnohostranné využití nejen v základním výzkumu (k izolaci genů nebo jejich částí, k přípravě značených sond, při sekvenování DNA) a aplikovaném genetickém výzkumu (k detekci mutací v genech, ke studiu polymorfizmu genů nebo v populační genetice), ale uplatňuje se i v klinických disciplínách (v prenatální diagnostice např. dědičných chorob, při detekci patogenních mikroorganizmů, k identifikaci onkogenů, ke stanovení pohlaví), v archeologii, kriminalistice (k identifikaci jedinců), v soudním lékařství (např. k určení paternity), v potravinářském průmyslu (k identifikaci falšování potravinářských výrobků) a v dalších vědních oborech (zoologie, botanika, mikrobiologie, parazitologie).

GELOVÁ ELEKTROFORÉZA patří k nejpoužívanějším separačním technikám sloužícím k izolaci a analýze nukleových kyselin a proteinů. Na tomto místě je vysvětleno použití gelové elektroforézy pro separaci různě dlouhých fragmentů DNA. Principem metody je pohyb záporně nabitých molekul DNA (hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny) v elektrickém poli směrem k anodě. Pomocí gelové elektroforézy můžeme separovat molekuly DNA na základě rozdílných rychlostí pohybu molekul DNA v gelu, které jsou nepřímo úměrné velikosti molekuly DNA. Elektroforéza se provádí na vhodném nosiči, nejčastěji v gelu tvořeném agarózou či polyakrylamidem (ve cvičení bude použita agaróza). Gel je tvořen složitou sítí polymerních molekul s póry, jimiž se různě velké molekuly DNA pohybují různou rychlostí (velké fragmenty pomaleji, malé fragmenty rychleji). Agarózový gel se připravuje v různé hustotě (udávané v % práškové agarózy). Agaróza se rozpouští v pufru, který je také obsažen v elektroforetické vaně jako elektrolyt (ve cvičení bude použit TBE pufr obsahující Tris, kyselinu boritou a EDTA). Vzorky se nanáší do jamek v gelu, které byly vytvořeny pomocí tzv. hřebínku. Zatížení DNA (klesne do jamky v gelu) a migrace DNA v gelu jsou zajištěny přidáním tzv. nanášecího neboli vkládacího pufru, který je tmavě zbarvený a je tak umožněna kontrola vložení PCR produktu do příslušné jamky a také migrace v gelu. Pro odhad velikosti pozorovaných DNA fragmentů se do jedné jamky gelu nanáší tzv. velikostní marker (hmotnostní standard, DNA ladder = žebřík) o definované velikosti jednotlivých fragmentů. Po proběhnutí elektroforézy je třeba separované fragmenty DNA zviditelnit. Pro vizualizaci DNA se používá značení barvivem, které se váže na DNA, např. ethidiumbromid nebo Midori Green (na cvičení bude použit Midori Green) a v UV záření v přístroji zvaném UV transiluminátor zviditelní fragmenty DNA. Pro detekci fragmentů DNA lze použít radioaktivní značení, nebo hybridizaci se značenou sondou (krátkým oligonukleotidem, který se komplementárně váže k hledané sekvenci). Rozdělené molekuly DNA lze také ve funkční formě izolovat z gelu.

RFLP (restriction fragment length polymorphism, polymorfismus délky restrikčních fragmentů) je metoda, jejíž podstatou je enzymatické štěpení molekul DNA ve specifickém restrikčním místě enzymem restrikční endonukleázou. Různé restrikční endonukleázy štěpí cílovou DNA v různých místech, v závislosti na sekvenci DNA. Po rozdělení vzniklých fragmentů pomocí gelové elektroforézy můžeme na základě velikosti a počtu fragmentů sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy. Polymorfizmy v délkách restrikčních fragmentů jsou způsobeny přestavbami (např. inzercemi, delecemi a substitucemi bází) ve studované sekvenci, které způsobí změnu počtu restrikčních míst. Využití např. k určení pohlaví u ptáků nebo určení otcovství (test paternity).

Obr.: Gelová elektroforéza.

Obr.: Určení otcovství na základě metody RFLP – DNA je izolovaná např. z buněk bukální sliznice a využita k amplifikaci specifické sekvence. Amplikon je následně rozštěpen enzymem a výsledné fragmenty jsou separovány gelovou elektroforézou. Výsledné fragmenty lze využít k vyloučení nebo potvrzení otcovství.

HYBRIDIZACE NUKLEOVÝCH KYSELIN je založena na specifickém spojení (hybridizaci, renaturaci) komplementárních nukleotidových sekvencí pocházejících z různých molekul NK. Základem hybridizace je obvykle značená sonda – krátký úsek DNA o známé nukleotidové sekvenci, s jejíž pomocí můžeme detekovat sekvenci k ní komplementární. Sonda může být značena fluorescenčně nebo radioaktivně. Nejčastěji bývá hybridizace prováděna na nosičích (viz Southernův přenos), ale je například možno hybridizovat NK i v intaktních buňkách (hybridizace "in situ").

Obr.: Princip hybridizace DNA (ss – jednořetězcová, ds – dvouřetězcová).

Postup Southern blottingu (Southernův přenos) + hybridizace:

1. Příprava a značení sondy.
2. Rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou.
3. Denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonovou membránu = Southern blotting.
4. Inkubace membrány se značenou jednořetězcovou sondou hybridizace (navázání) sondy s komplementární sekvencí DNA na membráně.
5. Odmytí nenavázané sondy.
6. Detekce navázané sondy = vizualizace (autoradiografie nebo stanovení fluorescence).

SEKVENOVÁNÍ DNA slouží ke stanovení pořadí (sekvence) nukleotidů v molekule DNA (primární struktury). Sekvenování DNA je založeno na přípravě, separaci a detekci fragmentů DNA, jejichž velikost se liší o 1 nukleotid. Enzymová (Sangerova, po Fredericku Sangerovi) metoda využívá modifikovanou PCR k syntéze kopií DNA, do nichž jsou začleňovány kromě deoxyribonukleosidtrifosfátů (dNTP) i dideoxynukleosidtrifosfáty (ddNTP), které postrádají hydroxylovou skupinu na 3’-konci, na kterou by se mohl navázat další nukleotid v nově vznikajícím řetězci. Tyto ddNTP tedy slouží jako terminátory syntézy (viz obr. 62). Samotná syntéza DNA pomocí PCR se provádí odděleně ve čtyřech vzorcích, přičemž každý z nich obsahuje jiný dideoxynukleosidtrifosfát (A, T, G, nebo C).

Polymerázová řetězová reakce využívaná při sekvenování DNA má další specifika. Amplifikace produktu probíhá pomocí tzv. asymetrické PCR, která na rozdíl od „klasické“ PCR využívá pouze jednoho primeru. Amplifikace PCR produktu tedy probíhá pouze na jednom řetězci DNA, na který se tento primer specificky váže, a kopie molekul DNA nepřibývají exponenciální řadou.

Reakční směs:

• templátová DNA
• 1 primer připojující se k místu na molekule DNA, od něhož chceme stanovovat sekvenci
• 4 typy normálních nukleotidů v nadbytku (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• jeden typ ddNTP v malém množství (v každém ze 4 vzorků je jiný)
• DNA polymeráza

Obr.: Chemická struktura dideoxynukleosidtrifosfátu (ddNTP) a princip terminace syntézy nově vznikajícího řetězce DNA po začlenění dideoxynukleosidtrifosfátu do nově vznikajícího řetězce DNA.

Postup enzymového (Sangerova) sekvenování:

1. Příprava ssDNA jejíž sekvence má být stanovena.
2. Rozdělení do 4 vzorků, z nichž každý obsahuje jiný ddNTP
3. Reakce s DNA polymerázou, při níž se začlení do různých míst syntetizované DNA příslušný ddNTP obsažený ve směsi. V každém ze 4 vzorků vzniknou fragmenty, které jsou zakončeny jedním typem ddNTP (ddCTP, ddGTP, ddATP, nebo ddTTP).
4. Denaturace produktů
5. Elektroforetická separace umožňující oddělení fragmentů lišících se délkou o jednu bázi
6. Detekce fragmentů

Automatické sekvenování DNA je variantou enzymatického sekvenování DNA. Syntéza DNA probíhá v jedné PCR reakci (každý ddNTP je značen jinou fluorescenční značkou) a vzniklé produkty (různě dlouhé úseky jednořetězcové DNA) jsou tak označeny jinou fluorescenční značkou. K následnému stanovení sekvence DNA vzniklých PCR produktů se využívá genetický analyzátor – "sekvenátor". Detekce těchto produktů probíhá během kapilární elektroforézy (=elektroforéza probíhá v tenké kapiláře naplněné gelem) pomocí laserového detektoru napojeného na počítač, který vyhodnocuje sekvenci.

Využití sekvenování DNA - sekvenování DNA má řadu aplikací ve vědě, medicíně a dalších oblastech. Sekvenují se celé genomy, případně jenom některé části, které mají pro daný obor význam. Ve fylogenetice představuje DNA sekvenování možnost studovat fylogenezi organizmů, kde se zpravidla sekvenuje DNA, která kóduje ribozomální RNA. Antropologie využívá srovnávání DNA ke zjišťování migrací lidských ras (zejména podle mitochondriální DNA a Y-chromozomální DNA). Má využití rovněž ve forenzních vědách a v kriminalistice k testování paternity nebo například umožňuje stanovení viny či neviny v případě podezření z trestné činnosti. V zemědělství má možnost využití například při tvorbě geneticky modifikovaných plodin V lékařství slibuje sekvenování DNA například revoluci v diagnostice chorob a časnému zjištění náchylnosti jedince k určitým nemocem (rakovina, kardiovaskulární onemocnění) a v neposlední řadě také možnost využití v genové terapii.

Sekvenování příští generace (NGS, next-generation sequencing) je dalším stupněm vývoje sekvenačních metod. Tyto nejnovější metody jsou založeny na paralelizaci procesu sekvenování a produkci tisíců až milionů sekvencí současně a umožňují tak velmi rychlé a relativně levné sekvenování ve velkých objemech. Díky rychle klesajícím cenám a zvyšující se dostupnosti se tyto metody rychle prosazují nejen při studiu celých genomů (tzv. celogenomové sekvenování) či jejich částí, ale také v rutinní DNA diagnostice v humánní medicíně, v cytogenetice aj.

GENOMIKA, BIOINFORMATIKA, BIOLOGICKÉ DATABÁZE A POČÍTAČOVÉ ZPRACOVÁNÍ BIOLOGICKÝCH DAT

Výše zmíněnými metodami automatického sekvenování DNA a sekvenování příští generace je dnes možno stanovit nukleotidové sekvence celých genomů. Komplexní analýzou genomů založenou na znalosti pořadí nukleotidů v DNA se zabývá obor genomika. V současné době je známa kompletní sekvence desítek genomů, a to nejen bakteriálních, ale i genomů vyšších organismů, např. kvasinky Saccharomyces cerevisiae (12 Mbp), drozofily (137 Mbp) a od roku 2000 je známá i nukleotidová sekvence lidského genomu (3 Gbp).

Genomové sekvence představují obrovský objem biologických dat, který nelze zpracovávat bez odpovídajícího počítačového vybavení. Pro účely přehledného uchovávání biologických dat, vyhledávání potřebných informací a jejich následné analýzy jsou využívány přístupy bioinformatiky. Termín bioinformatika se objevil poprvé v roce 1991, představuje spojení dvou technologií (oblast molekulární biologie a biotechnologií a oblast informačních technologií), u nichž došlo v posledních letech k explozivnímu růstu nových poznatků. Hlavní oblastí zájmu bioinformatiky je vyhledávání informací v databázích, srovnávání sekvencí nukleových kyselin a proteinů, vyhledávání genů, funkční genomika, klasifikace proteinů a proteomika, fylogenetické studie a srovnávací genomika.

Shromažďováním a správou dat, vývojem nástrojů pro jejich analýzu a poskytováním informací se ve světě zabývá několik institucí. Na internetových stránkách těchto institucí jsou veřejně přístupné biologické databáze, které obsahují rozsáhlé soubory dat (nukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí), které jsou obvykle spojeny s počítačovým softwarem pro aktualizaci a vyhledávání dat.

Nejdůležitější databáze sekvencí nukleových kyselin a proteinů:

• Databáze EMBL byla zřízená v roce 1980 jako první databanka nukleotidových sekvencí Evropskou molekulárně biologickou laboratoří (EMBL - European Molecular Biology Laboratory) ve Velké Británii. Je veřejně přístupná na stránkách Evropského institutu pro bioinformatiku (EBI - European Bioinformatic Institute) http://www.ebi.ac.uk.
• Databáze DDBJ zahájila svojí činnost v roce 1984, shromažďuje data především z japonských výzkumů. Databáze je spravována Centrem informační biologie (CIB - Center for Information Biology, založen v roce 1995 jako oddělení Národního genetického institutu) v Japonsku a je veřejně přístupná na adrese http://www.ddbj.nig.ac.jp.
• GenBank byla založena v roce 1992. Databázi nukleotidových sekvencí spravuje Národní centrum biotechnologických informací (NCBI - National Center for Biotechnology Information). Je přístupná na adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
• Swiss-Prot a TrEMBL je databáze zřízená v roce 1986 Švýcarským institutem pro bioinformatiku (SIB - Swiss Institute of Bioinformatics). Databáze obsahuje aminokyselinové sekvence proteinů a je přístupná na adrese http://www.expasy.org/sprot.

Množství molekulárně-biologických dat se zvyšuje tak rychle, že je nezbytné mít k dispozici prostředky, pomocí kterých můžeme k těmto datům snadno přistupovat. Existují tři prostředky na získávání informací, které jsou vstupním bodem do několika (až 80) integrovaných databází: Entrez (vyvinut v NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/), SRS (Sequence Retrieval System, vyvinut v EBI, http://srs.ebi.ac.uk/) a DBGET/Link DB (Integrated Database Retrieval System, vyvinut v Institutu pro chemický výzkum v Japonsku, http://www.genome.ad.jp/dbget/).

Nukleotidové sekvence můžeme pomocí počítačových analýz dále zpracovávat. Pomocí vhodného softwaru je možné identifikovat geny, jejich strukturu (exony a introny), nebo regulační oblasti (např. promotory, terminátory transkripce atd.). Na základě nalezených genů můžeme, opět s použitím vhodného softwaru, stanovit aminokyselinovou sekvenci proteinů kódovaných těmito geny a stanovit jejich základní charakteristiky (např. sekundární strukturu). Software vhodný k podobným analýzám je volně přístupný na Internetu např. na adresách http://www.ensembl.org nebo http://www.expasy.org.

Kromě výše zmíněné základní charakterizace lze také srovnávat nukleotidové sekvence různých buněk (organizmů, druhů atd.) mezi sebou, což je náplní komparativní (srovnávací) genomiky. Můžeme např. identifikovat rozdíly mezi genomy příbuzných druhů a určit tak jejich evoluční příbuznost (viz následující kapitola).

Podrobně popsané téma lze najít na tématických stránkách Molekulární biologie.

ÚKOLY - Metody molekulární biologie (viz úkoly)

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.