Biologie a genetika
pro bakaláře

Metody molekulární biologie

Cvičení z molekulární biologie jsou sestavena tak, aby se studenti prakticky seznámili se základními metodami, které se využívají k analýze DNA. Studenti si sami vyzkouší izolaci DNA, amplifikaci DNA pomocí PCR, restrikční štěpení PCR produktu, elektroforézu, vizualizaci DNA a hodnocení výsledku. Tyto metody budou využity při řešení jednoho komplexního úkolu. Bude se jednat o určení pohlaví ptačího jedince z biologického materiálu pomocí restrikční analýzy PCR produktu specifického genu. Každý student bude pracovat samostatně. Materiál k vyšetření bude zajištěn, ale lze si zajistit svůj vlastní materiál.

Instrukce k zajištění vlastního materiálu: K vyšetření lze použít jakékoliv ptačí buňky obsahující DNA. Lze odebrat krev od ptačího jedince zaživa, krev nebo orgány během porážky (kur, husa, kachna....), případně odebrat tkáň z drůbežího masa koupeného v tržní síti.

Ptačí krev:

• odběr do zkumavky s anti-koagulans EDTA (zkumavky budou k vyzvednutí u laborantky)
• požadovaný objem je minimálně 200 µl
• po odběru je třeba vzorek uložit do mrazáku při teplotě pod -15 °C

Ptačí tkáň (svalovina či vnitřní orgán):

• odběr do igelitového sáčku nebo mikrozkumavky
• o velikosti minimálně dvou špendlíkových hlaviček
• po odběru je třeba vzorek uložit do mrazáku při teplotě pod -15 °C

Vzorek je třeba označit (jméno studenta, číslo skupiny) a předat laborantce k evidenci a uložení do mrazáku ve cvičebně. Vzorky je potřeba přinést nejpozději do cvičení, kdy bude probíhat příprava tkáně k izolaci DNA.

Úkol 1 a 2: Příprava tkáně k izolaci DNA a vlastní izolace DNA

Izolace DNA se provádí pomocí izolační soupravy založené na principu adsorpce DNA na silikát. Vyšetřovaný materiál (ptačí krev či tkáň) je nejdříve lyzován pomocí lyzačního pufru (obsahuje detergenty, které rozpouští membrány a denaturuje proteiny) a enzymu proteinázy K (štěpí proteiny včetně histonů vázajících se na DNA). Buněčný lyzát se přenese na izolační kolonku, jejíž součásti je silikátový povrch (SiO₂ – sklo). V přítomnosti chaotropních solí (součást lyzačního pufru) adheruje DNA na silikát. Kolonka s DNA vázanou na silikát je promyta promývacími roztoky a následně uvolněna pomocí elučního pufru. Vzhledem k tomu, že různé izolační soupravy od jednotlivých výrobců se poněkud liší, pokud jde o jednotlivé komponenty (zejména použité roztoky a jejich pipetované objemy), není možné uvést vždy platný konkrétní sled kroků a je třeba se vždy řídit předepsaným postupem od příslušného výrobce, který vám bude k dispozici na cvičení.

Zásady práce:

• Každý student zpracovává vlastní vzorek a pracuje v pracovní skupině, která má k dispozici sadu automatických pipet.
• U pipet lze nastavit požadovaný objem - pozor na přetočení pipety mimo dané rozmezí.
• K zabránění kontaminace vzorku a chemikálií se pro jednotlivé kroky používá vždy nová špička.
• K zabránění kontaminace pipet se pro práci s DNA používá špička s filtrem.
• K zajištění přesného objemu je třeba důkladně nasadit špičku na pipetu.
• Požadovaný objem se získá stlačením pipety do první polohy a ponořením špičky pipety do nasávané tekutiny, povolením stlačení, přenesením požadovaného objemu a stlačením pipety do druhé polohy.
• Homogenizace vzorku se provádí ve zkumavce tzv. propipetováním tj. po přidání určité chemikálie do zkumavky třikrát opakovaně nasát směs do špičky a vytlačit.
• Mikrozkumavky je třeba označit číslem skupiny a pořadovým číslem studenta ve skupině.

Úkol 3: PCR

Příprava PCR:

1. Každá pracovní skupina si do mikrozkumavky (1,5 ml) připraví společnou PCR směs dle počtu vzorků (n) s rezervou (n+1):
   

   Směs pro jeden vzorek:

   • 10 µl - PCR master mix (směs nukleotidů dNTP, DNA polymerázy a Mg²⁺ iontů)
   • 0,2 µl - primer PP (pořadí nukleotidů: TCTGGATCGCTAAATCCTTT)
   • 0,2 µl - primer P8 (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) (R a Y - degenerované nukleotidy)
   • 7,6 µl - voda pro PCR
2. Napipetujte (novou špičkou) 18 µl PCR směsi do PCR mikrozkumavky (0,2 ml) označené fixem.
3. Napipetujte (špičkou s filtrem) 2 µl izolované DNA.
4. Uzavřete důkladně PCR mikrozkumavku, vložte ji do termocykleru a spusťte program.
5. Po dokončení programu bude PCR produkt uchován v lednici.
   

   Program PCR amplifikace (trvá asi 1 hod 55 min):

   

Úkol 4: Restrikční reakce s PCR produktem, elektroforéza, vizualizace a hodnocení

K určení pohlaví u ptáků se využívá gen CHD (Chromo-Helicase-DNA binding gene), který kóduje protein, jež reguluje aktivaci transkripce na úrovni chromatinu. Tento gen je u ptáků lokalizován na pohlavních chromozomech.

• Samčí pohlaví je u ptáků homogametické s pohlavními chromozomy ZZ.
• Samičí pohlaví je heterogametické s pohlavními chromozomy ZW.

Pomocí PCR je namnožena DNA odpovídající části genu na chromozomu W (CHD-W) a na chromozomu Z (CHD-Z). PCR produkt je štěpen pomocí restrikční endonukleázy (restriktázy) Hae III (izolované z bakterie Haemophilus aegyptius) v restrikčním místě:

PCR produkt genu CHD-Z toto místo obsahuje, proto dojde působením enzymu k odštěpení fragmentu DNA, zatímco PCR produkt genu CHD-W se enzymem neštěpí. Fragmenty jsou separovány pomocí gelové elektroforézy, vizualizovány pod UV zářením a vyhodnoceny.

Restrikční reakce:

1. Napipetujte 1,2 µl směsi restriktázy Hae III a aktivačního pufru do nové označené PCR zkumavky (0,5 ml).
2. Napipetujte (novou špičkou s filtrem) 10 µl PCR produktu.
3. Vložte do termocykleru při teplotě 37 °C na 45 min.

Příprava 1,2 % agarózového gelu:

Připraví se jeden gel pro všechny studenty ve cvičebně.

1. Do baňky typu Erlen dejte 1,2 g agarózy.
2. Skleněným válcem odměřte 100 ml TBE pufru, přidejte do baňky a kroužením promíchejte.
3. Dejte baňku do mikrovlnné trouby a vařte při teplotě nastavené na maximální ohřev po dobu 2 minut (jakmile začne obsah kádinky bublat, přerušte ohřev a promíchejte obsah kádinky v ruce s nasazenou rukavicí).
4. Po 2 minutách ohřevu vyjměte baňku z mikrovlnné trouby a opatrně ji ochlaďte pod tekoucí vodou na teplotu přibližně 60 °C (teplota, kdy několik sekund udržíme kádinku přiloženou ke hřbetu ruky).
5. Do rozehřátého roztoku agarózy napipetujte (novou špičkou) 3 µl Midori Green (10 tis. krát koncentrovaný roztok) a v ruce promíchejte.
6. Připravte si nalévací vanu a přelijte do ní rozehřátý roztok agarózy z baňky do výšky minimálně 8 mm.
7. Do vany vložte hřebínek a pipetovací špičkou odstraňte případné bubliny v gelu.
8. Gel ztuhne asi po 30 minutách.

Horizontální agarová gelová elektroforéza a vizualizace DNA

1. Po ztuhnutí gelu vyjměte hřebínek, otočte gel v elektroforetické vaně a zalijte TBE pufrem, tak aby byl celý gel ponořený.
2. Do jedné z jamek v gelu (nejlépe do prostřední) naneste 3 µl velikostního markeru.
3. Do sousední jamky naneste 10 µl směsného vzorku PCR produktu (směsný vzorek PCR produktu připravíte smícháním všech vzorků ve cvičebně).
4. Do dalších jamek nanáší (novou špičkou) každý student svůj vzorek, tj. 10 µl PCR produktu po restrikční analýze. S pipetou je třeba manipulovat opatrně, ať neprotrhnete gel.
5. Zapojte elektroforetickou vanu do zdroje a pusťte elektrický proud při konstantním napětí 160 V po dobu 15-20 minut.
6. Po ukončení elektroforézy přemístěte gel na UV-transiluminátor a pod UV zářením odečtěte výsledek. V rámci bezpečnosti je třeba pozorovat gel přes plastový kryt.

U samičího pohlaví: (ZW) se na gelu objeví 2 pruhy (bandy). Jeden větší, který odpovídá neštěpenému CHD-W (o stejné velikosti jako neštěpený PCR produkt) a druhý menší asi o 50 bp (párů bází).

U samčího pohlaví: dojde ke štěpení CHD-Z a na gelu se objeví jeden pruh o menší velikosti.

Obr.: Výsledek gelové elektroforézy: 1 – velikostní standard, 2 – neštěpený PCR produkt, 3 – samec, 4 – samice.

Úkol 5: Sekvenátor a sekvenování DNA

Než proběhne restrikční reakce nebo gelová elektroforéza navštivte Laboratoř sekvenční analýzy na Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat, kde se seznámíte s osmikapilárovým automatickým sekvenátorem (Beckman Coulter CEQ 8000), který slouží ke stanovení sekvence DNA na principu separace fragmentů DNA syntetizovaných terminační enzymovou Sangerovou metodou.

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.