Biologie a genetika
pro bakaláře

Buněčné a tkáňové kultury

Buňky, tkáně a dokonce i celé orgány (nebo části orgánů) mohou být udržovány (pěstovány) naživu mimo tělo v pufrovaném roztoku s živinami, tzn. za podmínek, jež věrně napodobují jejich fyziologickou situaci. V medicíně, biologii a příbuzných oborech se v souvislosti s pěstováním organizmů v umělých podmínkách ve zkumavkách či jiném laboratorním skle používá termín in vitro (z latiny "ve skle"). Naproti tomu termín in vivo (z latiny "v živém") znamená výskyt organizmů (popř. jejich orgánů nebo jejich jednodušších složek a látek) v přirozených podmínkách (u složek či orgánů to znamená na/v živém organizmu). Prvotní tkáně používané pro založení kultur v laboratořích jsou často získávány ze zvířat, ale mohou být použity i lidské tkáně (např. krevní buňky, buňky z pupeční šňůry, placenty a chrupavek).

Využití: Metody buněčných a tkáňových kultur mají v dnešní době význam např. při vývoji a ověřování nových léků, při výrobě vakcín, v testech toxicity, v diagnostice, jsou používány ke kultivaci a dlouhodobým pasážím nitrobuněčných parazitů nebo virů nebo při genových manipulacích. Využití buněčných a tkáňových kultur tak velkou měrou přispívá i k omezování pokusů na zvířatech.

HISTORIE

• Roux E. (1885) jako první kultivoval embryonální kuřecí buňky v solném roztoku mimo tělo. Problémem byla dlouhodobá kultivace, aniž by došlo k bakteriální kontaminaci. Tento problém později vyřešila antibiotika.
• Rous P. a Jones F.S. (1916) používali proteolytický enzym trypsin k natrávení kousku tkáně. Takto dispergované buňky bylo možno opakovaně pasážovat - počátek studií moderních tkáňových kultur.
• Eagle H. (1955) definoval složení média potřebné ke kultivaci buněk (tzv. Eaglovo médium). Do té doby se používala nepřesně definovaná média složená např. z krevní plazmy a extraktů hovězích embryí.
• Hayflick L. a Moorhead P. (1961) prokázali, že lidské fibroblasty ve tkáňové kultuře po určitém počtu generací podléhají krizi a umírají (viz fázová křivka růstu buněk v tkáňových kulturách).
• Wigler M. a Axel R. (1977) vyvinuli metodu pro vnášení savčích genů do buněk v kultuře.

TKÁŇOVÉ KULTURY jsou tvořeny buňkami, které nejsou od sebe odděleny, a proto mohou na sebe navzájem působit, tak jako v organizmu. Tkáňové kultury tak nacházejí využití např. při kontrole účinků teratogenů a při testování kožní dráždivosti.

BUNĚČNÉ KULTURY jsou tvořeny izolovanými buňkami, které jsou pěstovány v kultivačních nádobách, kde rostou v jedné vrstvě (tzv. monolayer). Modifikace metod tkáňových kultur umožňují pěstovat v kultuře celou řadu specializovaných buněk, nejpoužívanější jsou fibroblasty a epiteliální buňky. Buňky získané přímo z organizmu, jež jsou pěstovány v kultuře, jsou známy pod názvem primární buněčné kultury. Příležitostně se mohou tyto buňky spontánně přetransformovat do souvislých buněčných linií, jež jsou schopny přežít v podmínkách in vitro po mnoho let. Např. název buněčné linie HeLa je odvozen ze jména 31 leté Američanky Henrietty Lacksové, které byly odebrány buňky z nádoru děložního čípku v roce 1951. Ačkoliv buňky buněčné linie jsou si velmi podobné, často nejsou identické. Genetickou uniformitu buněčné linie lze zajistit klonováním buněk, kdy se z jedné izolované buňky vytvoří kolonie identických buněk, tzv. klony.

Příklady buněčných kultur:

KULTIVAČNÍ NÁDOBY - buňky se kultivují ve skleněných či plastových lahvích označovaných jako "Roux (čti 'ru') láhve" v termostatu při optimální teplotě (37 °C).

KULTIVAČNÍ MÉDIUM poskytuje buňkám optimální prostředí a slouží jako zdroj živin pro jejich růst. Přidává se do kultivačních nádob a pravidelně se musí vyměňovat za nové. Média (MEM = minimální esenciální médium) obsahují definované množství solí, glukózy, aminokyselin, vitaminů, inzulínu, transferinu, specifických růstových faktorů a bovinního fetálního séra. K prevenci bakteriální kontaminace se do média přidávají antibiotika (penicilin, streptomycin). Většina buněčných linií roste dobře při pH 7,4, při poklesu pH na 6,5 přestanou růst a při pH pod 6,5 ztrácí životaschopnost. Jako indikátor pH v médiu se používá fenolová červeň. Při pH 7,4 je zbarvení média červené, při poklesu pH (spotřebování živin, nahromadění metabolitů) se barva mění do žluta a to je signál pro výměnu média za čerstvé.

Inverzní mikroskop

KULTIVACE BUNĚK A PASÁŽOVÁNÍ - při práci s buněčnými kulturami (výměna média, pasážování buněk atd.) je potřebné dodržovat pravidla sterilní manipulace (používání boxů a germicidních lamp). Růst buněk v kultivační nádobě je možné průběžně pozorovat prostřednictvím speciálního inverzního mikroskopu. Buňky rostou v určitých fázích, které znázorňuje tzv. fázová křivka růstu. Většina buněk roste v kultivačních nádobách až do doby, kdy dosáhne vysokého procenta konfluence, tj. stavu, kdy buňky zaplní povrch dna nádoby a dostanou se do vzájemného kontaktu, čímž dochází k tzv. kontaktní inhibici. V té době je potřebné přenést (pasážovat) buňky do nové kultivační nádoby. Necháme-li buněčnou kulturu růst do vysoké hustoty, selektují se buňky, které ztrácejí normální kontrolu růstu a nepodléhají kontaktní inhibici. Takovéto buněčné linie nazýváme liniemi transformovanými. Podle způsobu růstu v kultuře a odlišnému způsobu pasážování lze buňky dělit na adherentní a suspenzní:

• Adherentní buňky adherují (přichycují se) na dno kultivační lahve v důsledku sekrece proteinů extracelulární matrix, jako např. lamininu, fibronektinu, kolagenu. Při výměně média se slije staré médium a nahradí se čerstvým, při pasážování se k uvolnění buněk ze dna lahve používá proteolytický enzym trypsin nebo jiná proteáza.
• Suspenzní buňky jsou volně dispergované v médiu. Při výměně média nebo pasážování je potřebné oddělit médium od buněk odstředěním.

Obr.: A – plastové láhve pro kultivaci buněk, B – fázová křivka růstu buněk.

ÚKOLY - Buněčné a tkáňové kultury (viz úkoly)

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.