Biologie a genetika
pro bakaláře

Vyšetření krve

Metody vyšetření krve a jejich využítí

HEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ

Krevní obraz (KO) – poskytuje údaje o počtu krevních elementů (erytrocyty, leukocyty, trombocyty), množství krevního barviva (hemoglobin) a hematokritu (procentuální podíl erytrocytů na objemu krve). Diferenciální rozpočet slouží ke stanovení počtu jednotlivých druhů bílých krvinek (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní, monofilní, lymfocyty, monocyty atd.). Používá se při screeningu, krevních chorobách a zánětlivých onemocněních.

Sedimentace erytrocytů (FW - podle Fahrea a Westergreena) – použití při screeningu, zánětlivých, infekčních a nádorových onemocněních.

Quick test – určuje protrombinový čas, použití při léčbě koagulancii.

APTT (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) – slouží ke zjištění koagulačních faktorů IX, XI, XII pro vnitřní srážení, použití při heparinizaci, léčbě streptokinázou a u hemofilie.

Krvácivost (srážlivost) – použití při krvácivých chorobách a předoperačních vyšetřeních.

Určení krevní skupiny a Rh faktoru

Coombsův test – slouží k rozpoznání imunohemolytické reakce při inkompatibilitě Rh faktoru dítěte a matky.

BIOCHEMICKÉ VYŠETŘENÍ

Ionty (ionogram nebo mineralogram) – stanovení koncentrace elektrolytů v krvi (Na, K, Ca, P, Mg, Fe atd.). Použití: součást screeningu, rozvrat vnitřního prostředí, poruchy činnosti ledvin, šok, zvracení, průjmy, poruchy srdeční činnosti.

Metabolity – produkty metabolismu (např. urea, kreatinin, bilirubin).

Bílkoviny – stanovujeme celkovou bílkovinu, albuminy, imunoglobuliny. Použití: posouzení stavu výživy, imunity nebo sledování vývoje zánětu.

Enzymy – např. transaminázy (ALT, AST, ALP), GMT, LDH, CK a amylázy. Použití: onemocnění jater, žlučových cest, pankreatu, kosterních svalů apod.

Lipidy – např. cholesterol, triglyceridy.

Hormony – např. TSH, T3, T4, aldosteron, progesteron, apod.

Tumorové markery – např. alfafetoprotein, CA, CEA, PSA.

Léky – např. Digoxin, Phenobarbital, atd.

Speciální metabolity – např. vit. A, B6, B12, C, D apod.

Toxiny – např. alkohol.

stanovení glykémie

stanovení acidobazické rovnováhy

MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ

bakteriologické – hemokultura

mykologické – plísně

virologické – viry

parazitologické – paraziti

SÉROLOGICKÉ VYŠETŘENÍ

Těmito vyšetřeními se stanoví hladiny některých protilátek, které vznikají jako odpověď na infekční agens (viry, bakterie a parazity). Příkladem je stanovení C-reaktivního proteinu (CRP), jehož koncentrace zejména při bakteriálních infekcích prudce stoupá.

Měření velikosti mikroskopických objektů

Měření velikosti objektu se provádí běžným mikroskopem, do jehož okuláru se vloží okulárový mikrometr. Je to kruhová, skleněná destička, na níž je vyryta 1 cm dlouhá úsečka rozdělená na 100 dílků po 0,1 mm. Okulárovým mikrometrem se provádí vlastní proměřování objektu. Jak velké dílky okulárového mikrometru se skutečně jeví v mikroskopu, lze zjistit porovnáním s jiným přesným měřidlem pozorovatelným celou optickou soustavou mikroskopu. K tomuto účelu slouží objektivový mikrometr, což je krycí sklo (přitmelené kanadským balzámem na podložní sklo), na kterém je vyryta 1 mm dlouhá úsečka rozdělená na 100 dílků, takže 1 dílek odpovídá 10 µm. Na začátku měření je nejdříve potřebné zjistit tzv. mikrometrický koeficient, tj. jaké hodnotě odpovídá jeden dílek okulárového mikrometru. K tomuto stanovení slouží okulárový mikrometr v jednom z okulárů a objektivový mikrometr, který se umístí na stolek mikroskopu a zastaví se jako běžný preparát. Otáčením okuláru s okulárovým mikrometrem se dají obě měřítka do takové polohy, aby byla vzájemně rovnoběžná. Potom se posouvá objektivovým mikrometrem tak, aby se jeho počáteční ryska kryla s počáteční ryskou okulárového mikrometru. Poté se hledá libovolný dílek objektivového měřítka, který se překrývá s dílkem okulárového měřítka (nejjednodušší je vzít pravý okraj kratšího měřítka a odečíst odpovídající hodnotu na okulárovém měřítku), hodnoty dílků se zaznamenají. Měření je potřebné provést pro všechna zvětšení objektivů. Při použití menších zvětšení je třeba hodně clonit a před přechodem na větší zvětšení (hlavně ze 40× na 100×) umístit objektivové měřítko do středu zorného pole, aby se neztratilo. Je třeba také počítat s tím, že objektivové měřítko se při větších zvětšeních také úměrně zvětšuje (pokud si nejste jisti, které měřítko je které, tak při otočení okulárem se otočí okulárový mikrometr).

Hodnota jednoho dílku okulárového mikrometru (mikrometrický koeficient) se vypočítá vydělením počtu dílků odečtených na objektivovém mikrometru počtem dílků odečtených na okulárovém mikrometru. Je nutné stanovit mikrometrický koeficient zvlášť pro jednotlivá zvětšení objektivů.

Obr.: Příklad stanovení mikrometrického koeficientu pro zvětšení objektivu 4× (100. dílek objektivového mikrometru odpovídá 40. dílku okulárového mikrometru – do vzorce pro mikrometrický koeficient dosadíme 100×10/40 = 25 µm).

Mikrometrické koeficienty pro různé objektivy: 25 (4×), 10 (10×), 2,5 (40×), 1 (100×)

Při vlastním měření mikroskopického objektu se umístí preparát na stolek mikroskopu a zjistí se, kolika dílkům okulárového mikrometru odpovídá měřený objekt. Tento počet dílků se vynásobí mikrometrickým koeficientem pro daný objektiv a výsledek se vyjádří v µm.

Transport látek, osmotické jevy (živočišná buňka)

Buňka, jako otevřená soustava, může žít jen za stálé výměny látek, energie a informací se svým okolím. Hlavní strukturou regulující buněčný příjem a výdej látek je cytoplazmatická membrána, která je polopropustná (semipermeabilní). Svou selektivní propustností zajišťuje, že koncentrace látek uvnitř buňky jsou udržovány na úrovni optimální pro život buňky. Mezi mechanizmy transportu látek přes membránu patří:

PŘÍMÁ (PROSTÁ) DIFUZE – závisí na fyzikálních vlastnostech membrány, která je propustná pro nízkomolekulární látky např. plyny, uhlovodíky, organické kyseliny, močovinu, etanol a vodu. Difuze závisí na rozdílu koncentrace daných látek uvnitř a vně buňky tj. na koncentračním spádu, teplotě a velikosti molekul. Difuze probíhá tak dlouho, až se koncentrace na obou stranách membrány vyrovnají. Zvláštním případem difuze je osmóza.

OSMÓZA – souvisí s polopropustností membrány, tzn. vodu propouští snadno, ale nepropouští látky ve vodě rozpuštěné. Je-li buňka obklopena izotonickým roztokem (roztokem o stejné koncentraci, jakou má cytoplazma), k průchodu vody membránou nedochází. Osmotické jevy nastanou tehdy, je-li buňka obklopena roztokem hypotonickým (o nižší koncentraci než má cytoplazma) nebo hypertonickým (o vyšší koncentraci než má cytoplazma).

Živočišná buňka:

• Hypotonické prostředí - do buňky začne proudit voda (endosmóza vody), buňka zvětšuje svůj objem, až praskne. Jev se obecně označuje jako plazmoptýza, u červených krvinek jako osmotická hemolýza.
• Hypertonické prostředí - z buňky začne proudit voda ven (exosmóza) a buňka se začne svrašťovat. Někdy se tento jev označuje jako plazmorhiza.

TRANSPORT POMOCÍ MEMBRÁNOVÝCH TRANSPORTNÍCH PROTEINŮ - specifický transport větších nenabitých polárních molekul (aminokyseliny, nukleotidy, cukry) a iontů (H+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO₃^-) pomocí kanálových proteinů, které vytváří póry (iontové kanály) pro difuzi rozpuštěných látek, nebo pomocí přenašečových proteinů na základě změny konformace (funkce turniketu).

ENDOCYTÓZA - příjem kapalin a různě velkých částic vchlípením plazmatické membrány a následnou tvorbou endocytotických váčků, které jsou přesouvány do lyzosomů, kde jsou stráveny. Příjem rozpuštěných látek se označuje jako PINOCYTÓZA, příjem pevných částeček je FAGOCYTÓZA.

EXOCYTÓZA – výdej kapalin a různě velkých částic buňkou.

Určování krevních skupin

KREVNÍ SKUPINY U LIDÍ

Krevní skupina	Aglutinogen	Protilátky
A	A	anti-B
B	B	anti-A
AB	A, B	-
O	-	anti-A, anti-B

Krevními skupinami (KS) obecně rozumíme všechny antigeny na membránách erytrocytů, které jsou schopné vyvolat tvorbu protilátek. Jedná se o proteiny (receptory, enzymy či transportní proteiny), glykoproteiny či oligosacharidy. Tyto antigeny se obvykle označují jako aglutinogeny. Protilátky (aglutininy) se v krevním oběhu vyskytují buď přirozeně, nebo je jejich tvorba vyvolána průnikem krvinek jiné KS do krevního oběhu. Shlukování krvinek v přítomnosti příslušných protilátek proti daným antigenům se označuje jako aglutinace a využívá se pro rychlé orientační stanovení KS. U člověka je známo více než 30 systémů krevních skupin. Mezi nejvýznamnější patří systémy AB0, Rh či MNS. V systému AB0 rozeznáváme čtyři základní krevní skupiny: A, B, AB a 0. Tento systém je nejstarší a nejvýznamnější. Jako první jej popsal rakouský vědec a lékař Karl Landsteiner v roce 1901 (a za tento objev dostal v roce 1930 Nobelovu cenu za medicínu). Landsteiner však popsal pouze tři krevní skupiny, A, B a C (dnes 0). Nezávisle na něm dospěl v roce 1907 ke stejnému objevu rovněž český lékař Prof. MUDr. Jan Janský. Ten ovšem správně identifikoval a klasifikoval všechny čtyři krevní skupiny, které sám označoval I, II, III a IV. Jedinci krevní skupiny A nesou na svých krvinkách aglutinogen A a tvoří protilátky anti-B, skupina B nese aglutinogen B a protilátky anti A. Skupina AB má oba aglutinogeny a žádné protilátky, skupina 0 nemá aglutinogeny (je přítomen jen jejich prekurzor) a tvoří protilátky proti oběma aglutinogenům.

Při transfúzi krve odlišné krevní skupiny hrozí akutní hemolýza: rychlá destrukce darovaných krvinek protilátkami příjemce a jejich následné odbourání prostřednictvím makrofágů a retikuloendoteliálním systémem.

URČOVÁNÍ KREVNÍCH SKUPIN U LIDÍ

K určení krevních skupin u lidí se používá "diagnostická souprava pro určování krevních skupin systému ABO (monoklonální)". Tato souprava obsahuje monoklonální Anti-A, monoklonální Anti-B, diagnostické karty a tyčinky k promíchání diagnostik s krevními vzorky.
Princip testu: aglutinační reakce, která je založena na reakci mezi antigenem (na povrchu erytrocytů) a protilátkou (reagencie v testu).
Postup: Do každého modrého kroužku karty se kápne po 1 kapce monoklonálního diagnostika Anti-A. Do každého žlutého kroužku se kápne po 1 kapce monoklonálního diagnostika Anti-B. Do červeného kroužku se kápne po 1 kapce krve (po píchnutí do prstu tenkou jehlou stisknout prst a vymáčknout kapku krve). Přiloženými tyčinkami se promíchají kapky monoklonálních diagnostik s kapkami krve a to každý vzorek samostatným koncem tyčinky.

Reakce s diagnostikem		Krevní skupina
Anti-A	Anti-B
+	-	A
-	+	B
+	+	AB
-	-	O

Hodnocení: Výsledky se odečítají do 1 minuty po promíchání za mírného kývavého pohybu diagnostickou kartou.

• Pozitivní reakce (aglutinace) indikuje přítomnost odpovídajícího antigenu na erytrocytech.
• Negativní reakce (bez viditelné aglutinace) indikuje chybění odpovídajícího antigenu na erytrocytech
• Příslušná krevní skupina se určí podle následující tabulky

Krevní skupiny v populaci lidí v ČR:

• A (45%)
• 0 (30 – 35%)
• B (15 – 20%)
• AB (5 – 7%)

ÚKOLY - Vyšetření krve (viz úkoly)

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.