Biologie a genetika
pro bakaláře

Teorie - mikroskopy - kompletní přehled

Na úvod aneb co vás čeká...

Do rukou se Vám dostává aktuální elektronická verze skript, která jsou určena pro Vás, především studenty bakalářského, ale i magisterského studia obou veterinárních fakult VFU Brno, pro praktická cvičení z předmětu Biologie a genetika nebo Biologie. Tato skripta vznikla za finanční podpory Operačního programu CZ.1.07/2.2.00/28.0287: "Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin".

Výuka biologie bude probíhat formou přednášek a praktických cvičení se zaměřením na obecnou biologii a základy genetiky. V souvislosti se změnou kurikula v magisterské formě studia došlo k redukci výuky ze dvou semestrů na jeden, v bakalářské formě studia bude probíhat výuka stále ve dvou semestrech. Na tyto změny jsme reagovali úpravou sylabů a to jak v přednáškách tak i ve cvičeních. V zimním semestru bude výuka pro obě formy studia probíhat stejně. Během 13 týdnů se budete věnovat především mikroskopické technice. Budeme tedy po Vás chtít, abyste byli schopni popsat mikroskop (jeho části a co k čemu slouží) a uměli ho správně používat při pozorování trvalých preparátů, které budete mít na cvičeních k dispozici. Sami si zhotovíte různé nativní preparáty, krevní nátěry, bakteriologické roztěry a otestujete si svoji krevní skupinu. Naučíte se, jaký je rozdíl mezi rostlinnou a živočišnou buňku, jakým způsobem se pohybují, jak reagují na různá osmotická prostředí a jak se rozmnožují. Biologie se v dnešní době neobejde bez moderních metod, proto Vás seznámíme s metodami molekulární biologie (izolace DNA, PCR, gelová elektroforéza a restrikční analýza) a to formou řešení konkrétního úkolu – zjištění pohlaví ptačího jedince. Po absolvování těchto cvičení budete znát principy jednotlivých metod, jejich význam a praktické využití. V zimním semestru využijete genetický model octomilku (Drosophila melanogaster) k jednoduchému experimentu, tak abyste si mohli ověřit, jak se dědí barva očí u tohoto hmyzu v dalších generacích.

Studenti bakalářského studia budou absolvovat praktickou výuku biologie i v letním semestru. Během 14 týdnů se seznámíte s viry a elektronovými mikroskopy, vyzkoušíte si, jak reagují buňky na různé fyzikální a chemické vlivy prostředí a seznámíte se i s pokusy na zvířatech a vše co s tím souvisí. Převážná většina cvičení bude ale věnována genetice a počítání genetických příkladů z oblasti mendelistické a nemendelistické dědičnosti, populační a kvantitativní genetiky. Po absolvování cvičení zvládnete jednoduchá genetická křížení (kombinační čtverec, ale i rozvětvovací metodu) k odhalení genotypů a fenotypů různých generací potomstva výchozího křížení a naučíte se, jakým způsobem se dědí krevní skupiny u lidí a zvířat. Pochopíte, jak se mohou geny vzájemně ovlivňovat, jak probíhá mitochondriální a chloroplastová dědičnost, jak ovlivňuje dědičnost pohlaví a vazba genů a jaký je rozdíl mezi kvalitativním a kvantitativním znakem. Tyto poznatky budete aplikovat i do genetiky populací. V rámci cvičení v letním semestru navštívíte muzeum J. G. Mendela v Brně, kde se blíže seznámíte s jeho prací, uvidíte včelíny a letní zahrádku, kde se věnoval genetickým křížením a v muzeu můžete obdivovat i model DNA. Studenti magisterského studia budou o letní část semestru ochuzeni, nicméně v rámci ZS budou rovněž řešit řadu genetických příkladů v rámci samostatné práce.

V těchto skriptech se můžete orientovat podle obsahu, který je rozčleněn do celků, zhruba tak jak budou probíhat na cvičeních. Každá kapitola začíná teoretickým úvodem do problematiky. Tuto část berte jako minimum znalostí, které od Vás budeme požadovat na cvičeních (je nutné, abyste na cvičení chodili připraveni!). Rovněž doporučujeme chodit na přednášky, kde se dozvíte o dané problematice více informací. Pro hlubší studium využijte seznam studijní literatury a studijních pomůcek na konci těchto skript. Za teoretickým úvodem najdete jednotlivé mikroskopické úkoly či genetické příklady. Skripta jsou doplněna o názorné obrázky, tabulky a grafy, vzorové genetické příklady, doporučenou literaturu a internetové odkazy. Další potřebné informace (sylaby, rozvrhy, přednášky, odkazy na multimediální pomůcky atd.) naleznete na webových stránkách Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat.

Přejeme Vám hodně studijních úspěchů a doufáme, že tato skripta Vám budou užitečnou pomůckou.

---

Metody získávání informací v biologických vědách

Každý vědní obor včetně biologie usiluje o získávání nových informací, které mohou doplnit nebo rozšířit stávající poznatky, nebo slouží k ověřování hypotéz. Hlavní metodou pro získávání nových údajů je pozorování, ke kterému je možné využít všechny naše smysly (především zrak), jejichž účinnost se může v kombinaci s přístroji (lupa, mikroskop) znásobit.

V biologii a medicíně lze k získávání informací využít i složitější postupy, které vyžadují speciální znalosti a techniku. Jedná se například o klinické, biochemické, serologické, hematologické, imunologické, mikrobiologické (bakteriologické, virologické, parazitologické), cytogenetické, histologické, či patoanatomické vyšetření. Lze využít různé postupy s využitím pokusných laboratorních zvířat, buněčných či tkáňových kultur nebo živných půd a v neposlední řadě i moderní metody molekulární biologie. Další důležité informace mohou být získávány např. ze zdravotní dokumentace, statistických přehledů, z rozhovoru, z dotazníků, z odborných časopisů a z různých databází přístupných na internetu. Některým metodám z oblasti biochemie, hematologie, bakteriologie, cytologie a molekulární biologie jsou věnované samostatné či dílčí kapitoly.

Další metodou získávání nových údajů je pokus (experiment), což je výzkumný postup, při kterém se zjišťují následky vyvolané u zkoumaného objektu změnou jednoho z faktorů, které na objekt působí. Při pokusu musí být dodrženo pravidlo jedné proměnné, musí být dobře definované a stabilní podmínky, které umožňují reprodukovatelnost pokusu. K vyloučení chyb a k porovnání výsledků pokusu slouží kontrolní nebo slepé pokusy. K vyhodnocení výsledků pokusů se využívají různé statistické metody. Pokusům na živých zvířatech je věnována jedna samostatná kapitola.

Jelikož hlavním cílem praktických cvičení z biologie je naučit se pozorovat a klasifikovat některé jevy v živé přírodě na mikroskopické úrovni, jsou první kapitoly věnovány mikroskopické technice.

---

Zvětšovací zařízení (lupa, světelný mikroskop)

Studium mikroskopických struktur a funkcí biologických objektů se neobejde bez použití zvětšovacích technických zařízení, která umožňují pozorování detailů pod hranicí rozlišovací schopnosti lidského oka (0,2 mm). Zvětšení rozlišovací schopnosti lidského oka je možné pomocí lupy nebo světelného mikroskopu, což jsou optická zařízení, která zvětšují obraz předmětu 2 – 1000× v závislosti na použité optické soustavě a druzích čoček.

Na cvičeních budeme používat světelné mikroskopy se zvětšením v rozsahu 40 – 1000× s rozlišovací schopností 0,2 µm. Mikroskopem prochází světelný paprsek (od toho název světelný mikroskop), který je usměrňován skleněnými čočkami.

ČOČKY jsou jednoduchá optická zařízení zhotovená ze skla nebo jiného čirého materiálu (kazivec, umělá pryskyřice). Podle lomu paprsků, které přicházejí do čočky rovnoběžně s optickou osou, se dělí čočky na spojky (spojné čočky), které lámou rovnoběžně přicházející paprsky do ohniska a obraz zvětšují a rozptylky (rozptylné čočky), které rozptylují rovnoběžně přicházející paprsky a obraz zmenšují.

LUPA je nejjednodušší optické zařízení, které umožňuje jen malá zvětšení a lze je využít např. ke studiu částí květů, drobnějšího hmyzu a planktonu. Lupy jsou složeny z jedné nebo více čoček spojných, které zvětšují 2 – 30×. Obraz pozorovaného objektu, vloženého mezi čočku a přední ohnisko, je přímý (nepřevrácený) a zvětšený. Na praktických cvičeních budeme používat lupu pouze pro pozorování octomilek (Drosophila melanogaster).

Vývoj světelných mikroskopů

"Spatřil jsem neuvěřitelné množství zvířátek plavajících čiperněji než cokoli, co jsem do té doby viděl. Největší z nich kroutila svými tělíčky a tak se pohybovala vpřed. A co víc - menších zvířátek bylo tolik, že voda vypadala jako živá." Citát pochází z dopisu, který roku 1674 zaslal Královské společnosti v Londýně holandský výrobce mikroskopů a amatérský pozorovatel mikrosvěta Anthoni van Leeuwenhoek. Optickou část mikroskopu tvořila jediná čočka, vzorek se umisťoval na hrot před čočku a mikroskop se držel v ruce těsně u oka. Leeuwenhoekovy mikroskopy zvětšovaly až 270× a jejich rozlišovací schopnost byla až 1,35 µm. Anthoni van Leeuwenhoek nebyl první výrobce mikroskopů. Už kolem roku 1595 vznikl v dílně Holanďana Zachariase Janssena mikroskop tvořený dvěma čočkami umístěnými na opačných koncích posuvného tubusu, zvětšoval pouze 9× a trpěl vážnými optickými vadami. Mikroskopy Angličana Roberta Hooka z roku 1665 poskytovaly sice větší zvětšení, ale i ony měly potíže s kvalitou zobrazení. Optické vady složených mikroskopů byly odstraněny až v 19. století, kdy firma Weiss začala vyrábět mikroskopy s vylepšenými optickými vlastnostmi skla.

Základní princip optického mikroskopu se od 19. století nezměnil. Už v dobách Carla Zeisse narazil na nepřekonatelné hranice dané fyzikálními zákony - zvětšení maximálně 1000× a rozlišení 0,2 µm. Byly však vyvinuty mnohé metody, které rozšířily možnosti badatelů. Aby se např. světelným paprskům usnadnila cesta skrz vzorek do objektivu, používá se u větších zvětšení tzv. imerze. Vědci se postupně naučili vzorky barvit různými barvivy, která se vážou pouze na určité buněčné struktury, např. na některé buněčné organely, a tím zvyšují jejich viditelnost. Pozorování v temném poli nebo v polarizovaném světle, Nomarského diferenciální kontrast, metoda fázového kontrastu (která umí využít rozdíly v rychlosti, jakou světlo proniká vzorkem, ke zvýraznění kontrastu) - to jsou jen některé z řady optických "triků", jimiž vědci dokáží zviditelnit zdánlivě neviditelné.

V minulosti měl výzkumník velmi omezené možnosti. Preparát mohl zabezpečit proti vyschnutí a uchovat, důležité objevy mohl překreslit, vyfotografovat, případně pomocí měřicí vložky v okuláru určit rozměry pozorovaných objektů. Dnešní mikroskopy propojené s počítači umožňují nejen pohodlnou archivaci digitalizovaných obrázků, ale i jejich podrobnou analýzu. Měření, výpočty buněčných objemů a koncentrací barevně odlišených látek, tvorba trojrozměrných modelů a skládání více obrázků do sebe se dnes stalo samozřejmostí.

Složení světelného mikroskopu

Část optická – objektivy, okuláry.

Část osvětlovací – zdroj světla, kondenzor, lamelová clona, filtry, zrcátko (v současných mikroskopech zabudované v podstavci).

Část mechanická – podstavec, stativ (nosič), tubus, revolverový měnič objektivů, stolek se svorkami a křížovým vodičem preparátů, makroposuv a mikroposuv (točítka hrubého a jemného posuvu).

ČÁST OPTICKÁ

Je tvořena dvěma čočkami nebo dvěma soustavami čoček. Soustava čoček, která je blíže k pozorovanému předmětu, je označována jako objektiv, druhá, která je blíže k oku, se označuje jako okulár. Předmět se umísťuje mezi jednoduchou a dvojnásobnou ohniskovou vzdálenost objektivu, kterým vzniká převrácený a zvětšený obraz. Tento obraz se dále pozoruje a zvětšuje okulárem.

OBJEKTIVY jsou optické soustavy složené z několika čoček, buď volných nebo tmelených dohromady. Soustavy čoček jsou uloženy ve válcovitých kovových pouzdrech, která jsou opatřena na jednom konci standardním závitem.

Charakteristické vlastnosti objektivů:

• Ohnisková vzdálenost (f) je vzdálenost čočky od ohniska, kolísá od 1,5 mm (objektivy nejvíce zvětšující) do 20 mm (objektivy málo zvětšující).
• Zvětšení (Z) je nepřímo závislé na ohniskové vzdálenosti objektivu. Čím kratší je ohnisková vzdálenost, tím je větší zvětšení a naopak. Z = 250/f, kde 250 = konvenční pracovní vzdálenost lidského oka v mm. Celkové zvětšení světelných mikroskopů používaných na cvičeních je v rozmezí 40× až 1000×.
• Volná pracovní vzdálenost je vzdálenost mezi čelní čočkou objektivu a krycím sklem preparátu. Volná pracovní vzdálenost se u více zvětšujících objektivů zmenšuje.
• Velikost zorného pole (plocha, kterou vidíme v mikroskopu) je závislá na okuláru a jeho cloně a na ohniskové vzdálenosti objektivu. Čím je ohnisková vzdálenost větší, tím je i zorné pole větší. Velikost zorného pole se u více zvětšujících objektivů zmenšuje (plocha, kterou v mikroskopu vidím se zmenšuje, vidím toho méně, ale ve větších detailech).
• Numerická apertura (NA) (apertura = otvor) je dána vzorcem: NA = n.sinα, kde n = index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem, α (alfa) = úhel svíraný optickou osou mikroskopu a pláštěm kužele, v němž se nacházejí paprsky, které z daného místa preparátu mohou vstoupit do objektivu a podílet se na zobrazení. Na numerické apertuře je závislá světelnost a rozlišovací schopnost objektivu. Čím více zvětšující objektiv, tím větší je i NA. Numerická apertura je jedna ze základních charakteristik objektivu a její hodnota je na objektivu uvedena.
• Rozlišení (d) je vlastnost objektivů rozlišit dva od sebe nepatrně vzdálené body ještě jako dva samostatné body. d = λ/NA, kde NA = numerická apertura, λ (lambda) = vlnová délka použitého světla. Čím větší je numerická apertura, tím je lepší rozlišení (tj. menší minimální vzdálenost mezi dvěma body). Čím kratší je vlnová délka, tím lepší je rozlišení. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 µm (objekty do této velikosti jsme schopni pozorovat, na menší objekty je třeba použít elektronový mikroskop).
• Světelnost objektivu je schopnost objektivu zachytit co nejvíce paprsků, které se podílejí na vytvoření reálného obrazu. Závisí na numerické apertuře a velikosti otvorového úhlu (alfa). Množství světla, které vniká do objektivu, je rovněž závislé na indexu lomu prostředí (n), kterým paprsky procházejí. Prochází-li světlo podložním a krycím sklem (n = 1,5) a pak vzduchem (n = 1), paprsky se lámou od kolmice, čímž mnohé z nich do objektivu vůbec neproniknou (obr. níže). Světelnost je možné zvýšit homogenizací prostředí (použitím tzv. imerze), která vede k tomu, že paprsky procházejí přímočaře a do objektivu vstoupí téměř všechny paprsky, které se podílejí na vzniku obrazu. Mezi látky užívané k homogenizaci prostředí patří např. cedrový olej (n = 1,519) a tekutý kanadský balzám (n = 1,515 až 1,530). Voda má index lomu prostředí n = 1,33.
  
  

  Obr.: A – poloviční otvorový úhel (?), svíraný optickou osou mikroskopu a pláštěm světelného kužele vnikajícího do objektivu. B – vliv indexu lomu prostředí mezi čelní čočkou objektivu a krycím sklem preparátu (u objektivu suchého a imerzního) na numerickou aperturu objektivu. U objektivu suchého (bez imerzního oleje) se šikmý paprsek (r) na rozhraní skla a vzduchu láme (odlišný index lomu) od kolmice a uniká mimo objektiv (r´). U imerzního objektivu proniká analogický šikmý paprsek (s) přímočaře sklem preparátu a imerzním olejem (stejný index lomu prostředí, paprsek se neláme) a je zachycen objektivem (s´). Imerzním olejem se tak zvyšuje světelnost objektivu.

• Penetrační schopnost (hloubka ostrosti) je schopnost objektivu zobrazit ostře současně několik optických rovin pozorovaného objektu. Je nepřímo závislá na numerické apertuře. Více zvětšující objektivy mají menší penetrační schopnost (je nutné proostřovat).

Typy objektivů:

1. Podle použitého média mezi objektem a čelní čočkou objektivu:
   1. suché - objektivy zvětšující 2 – 60× (existují i neimerzní 100× zvětšující objektivy, ale jejich cena je vysoká). Mezi objektem a čelní čočkou objektivu je vzduch (n = 1). Na cvičeních budeme používat suché objektivy 4 – 40×.
   2. imerzní - objektivy zvětšující 90 – 100× (výjimečně jsou vyráběny i 60× zvětšující imerzní objektivy). Mezi objektem a objektivem je umístěno médium (imerzní olej), které má přibližně stejný index lomu jako sklo preparátu, čímž se zvětšuje numerická apertura objektivu a s ní i světelnost a rozlišovací schopnost. Imerzní objektiv je odpružený, tj. je vybaven pružným uložením vstupní čočky, která se při dotyku krycího skla částečně zasune do pouzdra, čímž je objektiv chráněn před poškozením. Na cvičeních budeme používat imerzní objektiv 100×.
2. Podle optických vlastností (stupně úpravy různých vad čoček):
   1. achromáty jsou korigovány pro 2 barvy spektra (červená a modrozelená). Otvorová vada je korigována pro světlo žluté. Jsou používány pro běžnou mikroskopickou praxi.
   2. apochromáty mají korigovánu barevnou vadu pro 3 barvy spektra (žlutozelená, modrá a červená). Otvorová vada je korigována pro 2 barvy. Slouží pro zhotovování barevných mikrofotografií.
   3. planachromáty, planapochromáty mají korigované sklenutí zorného pole, které se jinak projevuje nemožností zaostřit rovinný objekt současně v celém zorném poli mikroskopu. Používají se pro zhotovování mikrofotografií.
   4. monochromáty jsou objektivy určené pro monochromatické světlo. Používají se např. při mikroskopování s využitím ultrafialového záření.

Barevná (chromatická) vada je způsobena optickou disperzí, tj. závislostí indexu lomu na vlnové délce světla. Bodový předmět je zobrazován na různá místa optické osy v závislosti na vlnové délce světla.

Otvorová (kulová, sférická) vada je způsobena tím, že objektiv je tvořen čočkami, které zdaleka nejsou tenké a navíc dochází i ke značnému odchylování paprsků od optické osy. Paprsky více odchýlené od optické osy jsou více lámány. Bodový předmět je pak zobrazován ne jako bod, ale jako úsečka ležící v optické ose.

Označení objektivu:

Na objektivech je vyznačen typ objektivu (např. A – achromát, PL – objektiv pro fázovou mikroskopii, označený také širokým rastrovaným černým prstencem), zvětšení, numerická apertura, délka tubusu v mm, doporučená tloušťka používaného krycího skla v mm, případně výrobce a výrobní číslo.

Obr.: Značení objektivu.

Barevné značení objektivů:

Pro snadnou orientaci jsou dnes objektivy barevně odlišeny. V tabulce jsou uvedeny pouze objektivy, které jsou využívány na cvičeních.

OKULÁRY představují druhý optický systém, který přispívá ke zvětšení obrazu. Okuláry jsou složeny ze 2 – 3 čoček. Směrem k objektu je tzv. čočka kolektivní, která obraz vytvořený objektivem zmenší, ale současně jej zjasní a zkoriguje některé vady objektivů. Blíže k oku je tzv. čočka očnicová (frontální), která působí jako lupa a obraz zvětší. Nejčastěji se používají tzv. okuláry Huyghensovy (negativní), složené ze dvou plankonvexních čoček, které jsou obráceny vypouklými plochami směrem k objektivu. Mezi čočkami je umístěna clona, která vylučuje postranní paprsky a je v rovině ostrosti obrazu. To umožňuje vkládat na tuto clonu okulárový mikrometr pro měření objektů. Běžné okuláry mají zvětšení 10× (jsou ale i okuláry se zvětšením 5×, 12,5×, 15×). Okuláry jsou výměnné, mají možnost nastavit vzdálenost očních pupil a rovněž provést dioptrickou korekci pro uživatele, kteří nosí brýle.

CELKOVÉ ZVĚTŠENÍ MIKROSKOPU (Z) se stanoví podle vzorce Z = d.250/f1.f2, kde d = optická délka tubusu, 250 = konvenční pracovní vzdálenost lidského oka v mm (250 mm), f1 = ohnisková vzdálenost objektivu v mm, f2 = ohnisková vzdálenost okuláru v mm.

Celkové zvětšení mikroskopu se rovná součinu zvětšení objektivu a okuláru:

Zvětšení u kreseb lze zapsat dvěma způsoby: jako celkové zvětšení (40×, 100×, 400×, 1000×), nebo ve zlomku jako zvětšení okuláru ku zvětšení použitého objektivu (10/4, 10/10, 10/40, 10/100).

ČÁST OSVĚTLOVACÍ (SVĚTELNÁ)

Slouží k usměrňování, koncentrování a homogenizaci světelných paprsků vycházejících ze světelného zdroje a procházejících přes objekt do optické části mikroskopu a do oka.

ZDROJ SVĚTLA - využívá se buď přirozené světlo (denní sluneční světlo), nebo umělé zdroje světla (osvětlovací žárovky, vysokotlaké rtuťové výbojky), které jsou součástí lamp (např. Šiklova lampa). U novějších mikroskopů je zdroj světla zabudován přímo v podstavci mikroskopu.

KONDENZOR je složen z několika spojných čoček uložených v pouzdru pod stolkem, které soustřeďují paprsky v podobě kužele na preparát. Kondenzor je opatřen irisovou clonou.

IRISOVÁ (LAMELOVÁ) CLONA je složena z vějířovitě uspořádaných lamel, které se překrývají a tak mění průměr centrálního otvoru, jímž procházejí paprsky ze zdroje světla, čímž je regulováno množství světla vstupujícího do kondenzoru.

ZRCÁTKO je důležité pro usměrňování a koncentrování světelných paprsků do kondenzoru. Mikroskopy se zabudovanými zdroji světla mají plochá kovová zrcátka vestavěna v podstavci mikroskopu.

FILTRY upravují světlo ze zdroje tak, aby bylo vhodné pro přímé pozorování nebo fotografické účely. Ochranné filtry (žluté a oranžové) brání průniku škodlivého UV záření do oka, žlutozelený filtr je používán při pozorování ve fázovém kontrastu k monochromatizaci světla, polarizační filtry slouží k polarizaci světla, modrý filtr (kobaltové sklo) zachytává žlutou složku ze světla umělého zdroje.

ČÁST MECHANICKÁ

Tvoří kostru mikroskopu a je nosičem optické a osvětlovací části mikroskopu.

PODSTAVEC vytváří základnu pro celý přístroj, ukrývá zdroj světla, zrcátko a nosič filtrů.

STATIV (NOSIČ) má tvar obráceného písmene L. Na stativu je připevněn revolverový měnič objektivů, tubus s okuláry, pohyblivý stolek s křížovým vodičem preparátu a pod stolkem je na nosič upevněn kondenzor.

TUBUS je trubice dlouhá 160 až 170 mm, do jejíž horní části se zasunují okuláry o standardním průměru 23 mm. Spodní část tubusu je pevně spojena s revolverovým měničem objektivů. Existuje monokulární, binokulární a trinokulární tubus (jeden výstup slouží pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery).

REVOLVEROVÝ MĚNIČ OBJEKTIVŮ je složen z vypouklého kovového kotouče s kruhovým otvorem a je upevněn na dolním konci tubusu, tak aby středem otvoru procházela optická osa mikroskopu. Pod ním je pohyblivě upevněný druhý kotouč se třemi nebo čtyřmi otvory na přišroubování objektivů.

STOLEK slouží pro uložení pozorovaného objektu do optické osy mikroskopu. Proto je ve stolku otvor, kterým procházejí paprsky z osvětlovací části mikroskopu přes objekt optickou soustavou mikroskopu. Stolek bývá čtvercový, částečně otočný, nebo kulatý a plně otočný. Součástí stolku je křížový vodič preparátů, který usnadňuje hledání pozorovaného objektu. Preparát se vkládá do upínací svorky křížového vodiče.

KŘÍŽOVÝ VODIČ PREPARÁTŮ umožňuje posunovat preparát pomocí sáňkového zařízení dvěma směry (dopředu a dozadu, doleva a doprava), což se označuje jako koaxiální ovládání. Zařízení je zpravidla opatřeno měřítky k určení souřadnic horizontální polohy sledovaného detailu v preparátu.

MAKROPOSUV A MIKROPOSUV (HRUBÝ A JEMNÝ POSUV) jsou uloženy oboustranně po stranách stativu. Oba umožňují zaostření obrazu pozorovaného objektu v zorném poli. Makroposuv je větší, je uložen blíže ke stativu a slouží k hrubému zaostření objektu. Mikroposuv je menší a slouží k jemnému a přesnému doostření, na svém obvodu nese mikrometrické měřítko, které je rozděleno na dílky po 2,5 µm, což umožňuje proměřování tloušťky (výšky) pozorovaných objektů.

Obr.: Popis světelného mikroskopu.

Druhy světelných mikroskopů

1. Podle způsobu pozorování:
   1. monokulární (1 okulár)
   2. binokulární mikroskop (2 okuláry)
2. Podle chodu paprsků světla:
   1. v procházejícím světle, mikroskop inverzní
   2. v dopadajícím světle
3. Podle druhu světla či osvětlení:
   1. pro pozorování ve fázovém kontrastu
   2. pro pozorování v temném poli (v zástinu)
   3. pro pozorování v polarizovaném světle, Nomarského diferenciální kontrast
   4. fluorescenční
   5. konfokální

Monokulární mikroskop slouží pro pozorování jedním okem s možností využití druhého oka ke kreslení.

Binokulární mikroskop slouží pro pozorování oběma očima současně. Obraz je systémem hranolů rozložen do dvou okulárů. Binokulární hlavice má vlastní zvětšovací optickou soustavu, se kterou je nutno kalkulovat při výpočtu celkového zvětšení pozorovaného objektu. Rozestup optických os okulárů lze přizpůsobit vzdálenosti očí, dioptrické rozdílnosti očí jsou kompenzovány dioptrickým doostřováním.

Mikroskopy pro pozorování v procházejícím světle – světlo přicházející ze zdroje je pomocí zrcátka odraženo do kondenzoru, kde je rovnoměrně rozloženo a koncentrováno na poměrně malou plochu.

Mikroskop inverzní má optickou soustavu "vzhůru nohama", tj. jeho osvětlovací souprava a kondenzor jsou umístěny nad preparátem, zatímco objektivy jsou pod ním. Tento mikroskop je určen např. pro pozorování tkáňových kultur v kultivačních nádobách (viz buněčné kultury).

Mikroskopy pro pozorování v dopadajícím světle jsou určeny pro pozorování objektů, které jsou opacitní (nepropouštějí světlo), využívají se v mineralogii a metalurgii. Do této kategorie se řadí i preparační mikroskopy.

Výše zmíněné typy mikroskopů mohou být vybaveny příslušenstvím pro pozorování objektů za speciálních podmínek (např. pozorování ve fázovém kontrastu, v temném poli, v ultrafialovém, polarizovaném nebo interferenčním světle).

Mikroskopy pro pozorování ve fázovém kontrastu - k získání dostatečně kontrastního obrazu lze využít jednak barvení a jednak skutečnost, že světelné paprsky procházející prostředím, ve kterém dochází k lomu světla, se opožďují (fázový posun). Princip fázového kontrastu vychází z jevů, které nastávají při ohybu (difrakci) světelných paprsků na optické mřížce a při jejich interferenci. Za jeho objev obdržel holandský fyzik F. Zernike v r. 1953 Nobelovu cenu za fyziku.
Fázový kontrast je vhodný pro pozorování nativních nebarvených preparátů, nejlépe živých objektů, které se ve fázovém mikroskopu jeví jako tmavě nebo světle konturované. Pro pozorování ve fázovém kontrastu lze použít běžný mikroskop s použitím speciálních pomůcek, jako je fázový kondenzor (10 nebo 40), jemu odpovídající fázový objektiv (10× nebo 40×, s označením PL a černým gumovým prstencem) a pomocný mikroskop. Po vycentrování prstencových clon fázového kondenzoru a objektivu je mikroskop připraven k pozorování ve fázovém kontrastu. K pozorování je možné použít žlutozelený filtr, který propouští zelené světlo o vlnové délce 540 nm, které zvyšuje kontrast obrazu.

Příprava mikroskopu pro pozorování ve fázovém kontrastu:

• Vysunout držák filtru ze spodní části kondenzoru a místo něj dát fázový kondenzor s označením 10 nebo 40.
• Kondenzor posunout co nejblíže pod stolek a úplně otevřít clonu.
• Nastavit na mikroskopu odpovídající objektiv pro pozorování ve fázovém kontrastu (10× nebo 40×, s označením PL a černým gumovým prstencem).
• Do tubusu okuláru vsunout místo jednoho okuláru pomocný mikroskop, zaostřit ho vysunutím jeho vnitřní části a poté utáhnout šroubek na boku pomocného mikroskopu.
• Pomocí šroubků na bocích fázového kondenzoru vycentrovat prstencové clony fázového kondenzoru a objektivu.
• Vysunout pomocný mikroskop z mikroskopu a místo něj dát normální okulár, mikroskop je připraven k pozorování ve fázovém kontrastu.
• Objekty je možno pozorovat s použitím kulatého skleněného zeleného nebo žlutozeleného filtru, který se vkládá na zdroj světla.

Obr.: Fázový kondenzor a fázové clony: A – nevycentrované, B – vycentrované.

Mikroskopy pro pozorování v temném poli (v zástinu) vyžadují zvláštní osvětlovací část (paraboloidní kondenzor), která propouští pouze šikmo procházející paprsky. Tím je objekt osvětlen pouze ze stran a zorné pole je tmavé. To umožňuje pozorovat objekty mnohem menší než ty, které je možno pozorovat v procházejícím světle. Této metody se využívá např. k diagnostice bakterií (leptospiry, Treponema pallidum), které nelze v procházejícím světle vidět.

Mikroskopy pro pozorování v polarizovaném světle slouží ke zjišťování dvojlomu různých látek. V okuláru nebo těsně pod ním je uložen polarizační filtr označovaný jako analyzátor a pod kondenzorem je umístěn druhý filtr - polarizátor. Vloží-li se mezi oba polarizační systémy objekt, který obsahuje látku opticky aktivní (tj. stáčí polarizační rovinu o určitý počet stupňů), dochází k průchodu světla. Optická aktivita se dá přesně odečíst ve stupních otáčením jednoho z obou filtrů.

Nomarského diferenciální kontrast využívá vlastnosti světla ke zvýšení rozdílů v jasu mezi různými částmi vzorku. Pracuje s polarizovaným světlem, které se na dvojlomných hranolech dělí na dva nepatrně posunuté obrazy. Výsledek působí dojmem šikmo osvětleného trojrozměrného objektu.

Mikroskopy fluorescenční patří mezi světelné mikroskopy, které využívají zajímavé vlastnosti některých látek. Při osvícení světlem o určité vlnové délce dojde k vymrštění elektronů v jejich atomech na energeticky bohatší dráhy kolem atomových jader. Při návratu elektronů na původní dráhu dojde k uvolnění energie ve formě záření o jiné, delší vlnové délce, než mělo záření, které celý efekt způsobilo. Jinými slovy látka se rozzáří. Fluorescenční mikroskopy, sériově vyráběné od 70. let 20. století, využívají tento princip k získání unikátních obrázků. Vzorek se vystaví záření o vlnové délce, která dokáže vyvolat fluorescenci některé z látek ve vzorku. Fluorescence vytváří obraz pozorovaného objektu. Oblasti vzorku, v nichž k fluorescenci nedošlo, zůstanou tmavé, protože zbytkové záření je odfiltrováno. Mnohé přírodní látky, např. chlorofyl nebo některé vitaminy září pod vlivem UV paprsků. Fluorochromy jsou sloučeniny schopné fluorescence, které se využívají ke zviditelnění různých součástí buněk, např. DNA, proteinů (bílkovin). V mikroskopu je viditelná fluorescence v místě, kde se navázal fluorochrom na danou látku. Tato metoda se např. v kombinaci s přímými nebo nepřímými imunologickými metodami používá např. při diagnostice vztekliny.

Mikroskopy konfokální se začaly objevovat ve druhé polovině 80. let. Tyto mikroskopy využívají fluorescence ještě dokonaleji. U běžných fluorescenčních mikroskopů dopadá na detektor i světlo vyzářené z vrstev vzorku ležících nad a pod rovinou ostrosti. Konfokální mikroskop tento "světelný šum" odstraňuje. V cestě paprsku stojí zábrana s miniaturním otvorem, jenž propustí pouze světlo z právě zkoumaného místa, výsledkem je ostrý obraz. Zdrojem světla vyvolávajícím fluorescenci vzorku je u konfokálního mikroskopu laser, jehož paprsek míří pouze do jediného místa. Paprsek se obrovskou rychlostí bod po bodu posouvá, takže postupně osvítí celý vzorek. Údaje získané z jednotlivých bodů se v počítači složí do úplného obrazu. Laserový paprsek je možné zaměřit do jiné hloubky a postupně tak pořídit obraz z dalších vrstev vzorku. Mikroskop tak vytváří "optické řezy", jako by vzorek rozřezal na tenké plátky. Kdyby se jich na sebe poskládalo tisíc, byly by vysoké pouze 0,5 milimetru. Počítačovým zpracováním řezů lze vytvořit trojrozměrné modely zkoumaných struktur nebo animaci procházející vzorkem od povrchu až do hloubky několika desetin milimetru. První laserový konfokální rastrovací mikroskop byl vyroben r. 1978. Konfokální mikroskop je velmi citlivý, pro získání obrazu stačí malé množství barviv, což má význam pro pozorování živých buněk, kterým barvení příliš nesvědčí.
Konfokální mikroskopy se používají k tzv. "life cell imaging", který umožňuje sledovat funkce vnitrobuněčných struktur in vivo a to až na molekulární úrovni: růst buněčných kultur v reálném čase, sledování účinků fyzikálních a chemických faktorů na buněčné kultury, studium mechanizmu buněčného dělení a zejména jeho poruch v somatických buňkách, buňkách zárodečné linie i raných embryích.

---

Mikroskopická technika

POTŘEBY K MIKROSKOPOVÁNÍ
Laboratorní sklo: podložní skla (76 × 26 × 1-1,2 mm se zabroušenými okraji nebo bez zábrusu), krycí skla (čtvercového nebo obdélníkového tvaru 18 × 18, 22 × 22, 30 × 40 mm), kádinky, zkumavky, Petriho misky, střičky, odměrné válce, nálevky
Nástroje: kahan, nůžky, skalpel, pinzeta, bakteriologická klička, preparační jehla, kapátko
Přístroje: mikroskop, lupa, vodní lázeň
Chemikálie: kyseliny, hydroxidy a jejich soli, barviva, imerzní olej

PŘÍPRAVA MIKROSKOPU K MIKROSKOPOVÁNÍ znamená umístění mikroskopu tak, aby nosič tubusu byl od pozorovatele odvrácen a volná strana mikroskopického stolku směřovala k němu. Mikroskop musí být snadno v dosahu, aby pozorovatel mohl pohodlně sedět. Nejlépe je psát záznamy vpravo od mikroskopu a vlevo si umístit potřeby pro přípravu preparátů (leváci naopak). Mikroskop se spouští spínačem umístěným v podstavci mikroskopu. Pokud přerušujete mikroskopování pouze na čas, mikroskop nevypínejte (opakovaným zapínáním se zkracuje životnost žárovky). Preparát se vkládá do rohu upínacího zařízení stolku a poté se uchytí svorkou. Při mikroskopování se postupuje od nejméně zvětšujících objektivů po nejvíce zvětšující, tj. 4×, 10×, 40× a 100×.
Při zvětšení 40× a vyšším je vhodné korigovat optické vady očí, protože většina lidí nemá obě oční čočky stejně dioptricky silné. Nejdříve je třeba upravit rozestup okulárů (oční rozestup) a poté se snažit pozorovat obraz oběma očima. Pozorování jen jedním okem vyvolává jeho neúměrnou zátěž a při opakovaném zatěžování zhoršuje vady oka. Rozdíl vede opět k neúměrnému zatěžování jednoho oka. Vadu je možné kompenzovat úpravou dioptrické síly levého okuláru takto: zavřete levé oko a obraz dokonale zaostřete mikrošroubem při pozorování pravým okem v pravém okuláru, zakryjte si pravé oko a pozorujte obraz levým okem v levém okuláru. Pokud není obraz dokonale ostrý, zaostřete objekt pomocí točítka dioptrické korekce na levém okuláru. Poté byste měli oběma očima vidět stejně ostře. Vyhledáním optimální vzdáleností očí od okulárů docílíte při troše cviku splynutí obrazu z obou okulárů a obě oči tak budete zatěžovat rovnoměrně.

ZASTAVENÍ OBJEKTU V ZORNÉM POLI MIKROSKOPU znamená umístění objektu do středu zorného pole a zaostření a osvětlení obrazu objektu v zorném poli. Preparát se pokládá na stolek mikroskopu pod pérovou svorku tak, aby objekt nebo krycí sklo byly umístěny nad otvorem stolku směrem k objektivu (podložním sklem dolů a krycím nahoru). Při zastavování objektu v mikroskopu je třeba se dívat do mikroskopu a současně pomocí křížového vodiče pohybovat preparátem na stolku mikroskopu a pomocí makroposuvu najít správnou volnou pracovní vzdálenost. Jakmile se v mikroskopu objeví objekt, provede se doostření pomocí mikroposuvu. Je třeba si také seřídit osvětlení mikroskopu pomocí regulátoru osvětlení (v podstavci mikroskopu) a zvýšit hloubku ostrosti pomocí irisové clony kondenzoru. Při pozorování málo kontrastních objektů (epitelie, objektivový mikrometr, pylová zrna) je potřeba více zaclonit a zaostřit na správnou optickou rovinu. Při pozorování preparátů je potřeba dát si pozor na tzv. artefakty (termín poprvé použil Sir Julian Huxley), jako jsou např. škrábance, kazy ve skle, bubliny, prach, útvary z želatiny apod., které bývají zaměňovány za pozorované objekty.

Nejčastější chyby (závady) a jejich odstraňování:

Do velkých zásahů a oprav mikroskopu se nepouštějte, výjimkou jsou některé technické závady, které můžete sami odstranit:

Chyba (závada)	Příčina	Odstranění
mikroskop nesvítí	šňůra není v zásuvce nebo není zastrčena "nadoraz" do mikroskopu	zastrčit šňůru do zásuvky a do mikroskopu "nadoraz"
makroposuv jde ztuha	špatné nastavení tuhosti chodu	natočte točítko makroposuvu proti směru hodinových ručiček
mikroskop samovolně sjíždí	špatné nastavení tuhosti chodu	natočte točítko makroposuvu ve směru hodinových ručiček
neostrý obraz, nejde zaostřit při použití objektivu 40x	preparát je krycím sklem dolů	položte preparát správně
	zalepený objektiv	vyčistěte objektiv
obraz je zamlžen	znečištěný objektiv (prach, olej)	objektiv očistěte od prachu a otřete hadříkem (vatovým tamponem) navlhčeným v alkoholu
	znečištěný okulár (při otáčení okulárem se otáčí i nečistota)	očistěte okulár od prachu, otisků prstů apod.
nedostatečné osvětlení obrazu	kondenzor je příliš nízko	posuňte kondenzor a nastavte nejlepší osvětlení
osvětlená jen část obrazu, abnormální zorné pole	neúplně otočena revolverová hlavice objektivů při střídání objektivů	otočte revolverovou hlavici až po zaklapnutí západky (pořádně "docvaknout" objektiv)
obraz je málo kontrastní	velký otvor u clony kondenzoru	přivřete irisovou clonu kondenzoru
nedaří se nalézt objekty při malém zvětšení	málo kontrastní objekty (epitelie, objektivový mikrometr, ale i pylová zrna)	více zaclonit a zaostřit na správnou optickou rovinu
objekt zmizí při přechodu na větší zvětšení 40× a 100×	objekt je umístěn na okraji zorného pole	vrátit se k menšímu zvětšení, a umístit objekt do středu zorného pole (středit)
vibrace preparátu, vzduchové bubliny	moc nebo málo vody	optimalizovat množství vody přidávané k preparátu
záměna za artefakty	hledání mimo správnou optickou rovinu	zaostřit na správnou optickou rovinu
nejde rozlišit objekty	tlustý preparát, příliš mnoho materiálu	připravit tenkou homogenní vrstvu

Fáze a zásady mikroskopování:

1. Umístění mikroskopu před sebe, tak aby byl snadno v dosahu, a aby pozorovatel pohodlně seděl (mikroskopem během mikroskopování nepohybovat - při velkých zvětšeních se objekt může ztratit). Kontrola kompletnosti mikroskopu a zapnutí mikroskopu.
2. Prohlédnutí preparátu nejdříve pouhým okem ke zjištění polohy, velikosti nebo obarvení objektu (na některých preparátech je fixem v kroužku vyznačeno, kde je třeba objekt hledat). Hledat v obarvené části preparátu.
3. Umístění preparátu na stolek pod pérovou svorku (krycím sklem nahoru) a umístění objektu (pokud je viditelný pouhým okem) do dráhy světelného paprsku (ověřit z dálky při otevřené irisové cloně).
4. Seřízení rozestupu okulárů a kontrola nastavení dioptrického doostřování.
5. Levá ruka ovládá makrošroub a mikrošroub k vyhledání správné optické roviny a zaostření, pravá ruka ovládá křížový posun k vyhledávání objektů. K systematickému prohlížení preparátu slouží meandrovitý způsob.
6. Pozorování objektu nejdříve pod málo zvětšujícími objektivy (4× a 10×), středně zvětšujícími objektivy (40×) a nakonec pod imerzním objektivem (100×). Objektivy 40× a 100× nejsou na vyhledávání objektu, ale na detailní prohlédnutí objektu nalezeného při menších zvětšeních. Při použití objektivů 4× a 10× ostřit makrošroubem, při použití objektivů 40× a 100× ostřit mikrošroubem.
7. Při každém zvětšení je potřeba upravit množství procházejícího světla pomocí regulátoru napětí v podstavci mikroskopu a zvýšením hloubky ostrosti pomocí irisové clony. Při malém zvětšení co nejvíce zaclonit (uzavřít irisovou clonu) a přitom přidat světlo na zdroji (ne přidušené oranžové). Při větších zvětšeních je třeba postupně přidávat osvětlení otvíráním irisové clony.
8. Před každým použitím více zvětšujícího objektivu je třeba objekt umístit do středu zorného pole (tzv. středění objektu).
9. Záznam o pozorování (protokol – kresba, popis, závěr).
10. Před vytáhnutím preparátu z mikroskopu je dobré vrátit se k nejméně zvětšujícímu objektivu - preparát se díky většímu prostoru bezpečněji vyndá. Očištění preparátu a objektivu od imerze alkoholem, vypnutí mikroskopu a jeho přikrytí igelitovým krytem.

MĚŘENÍ VÝŠKY (TLOUŠŤKY) OBJEKTU se provádí pomocí mikrometrického měřítka vyrytého na objímce mikroposuvu. Obvod tohoto šroubu je rozdělen na 50 dílků po 2,5 µm. Při měření se postupuje tak, že se zaznamená hodnota dílku na měřítku při zaostření detailu objektu v horní optické rovině a poté se odečte hodnota dílku na měřítku při zaostření detailu objektu v dolní optické rovině. Počet dílků (rozdíl mezi odečtenými hodnotami) násobený 2,5 µm představuje skutečnou výšku (tloušťku) objektu v µm.

Výška (tloušťka) objektu v µm = 2,5 x počet dílků otočených mezi horní a spodní optickou rovinou.

ÚKOLY - mikroskopická technika (viz úkoly)

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.