Cvičení č. 1

Téma :

Mikroskopické vyšetření potravinových surovin

Cíle cvičení :

  1. Postup při odběru vzorků surovin a potravin
  2. Zpracování vzorků a příprava preparátů pro světelnou mikroskopii
  3. Postupy pro získání kontrastu – barvení

Odběr vzorků

Součástí odběru vzorků je vždy smyslové vyšetření, zaměřené na hodnocení obecně sledovaných znaků a specifických požadavků podle druhu suroviny. Smyslové vyšetření je vodítkem pro odběr vlastních vyšetřovaných vzorků. Potravinové suroviny jsou velmi různorodým materiálem, zejména pokud se týká jejich konzistence.

Základní principy odběru vzorků :
  1. minimálně 3 vzorky z různých míst suroviny, v případě suchých práškových surovin se vytvoří směsné vzorky
  2. pokud se fixují, pak je velikost vzorků pro fixaci asi 1 cm3
  3. počet vzorků se může zvýšit v případě výskytu podezřelých míst

Příprava mikroskopických preparátů – základní schéma

  1. tuhé suroviny, které podléhají kažení (zejména o suroviny živočišného původu) :
    1. se do zpracování uchovávají ve fixační tekutině potom následuje postup, kterým získáme preparát k posouzení - odvodnění, zalití do parafínu, krájení, odparafínování, barvení a montování
    2. vzorky se zmrazí a krájí se přímo řezy, barví se a montují
  2. tekuté nebo roztíratelné vzorky se natřou v tenké vrstvě na podložní sklo, nechají se zaschnout a zamontují
  3. suché materiály nevyžadují zvláštní podmínky pro úchovu :
    1. lze je rovněž rozetřít v tenké vrstvě na podložní sklo
    2. další možností je jejich rozmíchání v tekutém parafínu a vytvoření parafínového bločku, ze kterého se krájí řezy, dále se postupuje jako v bodě 1.

Fixace vzorků

 Fixací rozumíme rychlé vysrážení (denaturaci ) bílkovin protoplazmy buněk a tkání fixačními prostředky, které mají zabránit samovolnému rozkladu živé tkáně - autolýze. Postup při fixaci zahrnuje použití prostředků dvojího druhu – fyzikální (zejména suchým teplem) a chemické. V případě zpracování surovin živočišného původu využíváme zejména chemické prostředky. Jsou roztoky organických nebo anorganických sloučenin, popř. jejich různé kombinace nebo směsi. Každý chemický fixační prostředek by měl splňovat základní podmínky - musí do tkáně rychle pronikat, nesmí hrubě srážet cytoplazmatické proteiny, ale tvořit s nimi co možná nejjemnější nerozpustný gel, nesmí nepříznivě ovlivnit další zpracování vzorku.

Zásady při fixaci :
Nejpoužívanější fixační tekutiny :
FORMOL (FORMALIN) - dodává se ve 40% koncentraci, používá se jako 10% nebo 5% roztok, ředí se vodovodní vodou. Působením světla se rozkládá, proto se musí uchovávat v temnu. Na dně lahve má být asi 20 mm vrstva uhličitanu vápenatého pro neutralizaci kyseliny mravenčí. Je též součástí některých fixačních směsí. Doba fixace je minimálně 24 hodin (podle velikosti vzorku), avšak její délka není omezena. Vzorky se po fixaci obvykle vypírají pod tekoucí vodou (zamezení výskytu formolpigmentu).

Další fixační tekutiny :
BODIANOVA TEKUTINA - doba fixace je 24 - 48 h.
Obsah : formol 40%, kyselina octová ledová, etanol 80%
CARNOYOVA TEKUTINA - doba fixace je 3 – 5 h (nesmí se přetáhnout – tkáně se pak nedají zpracovat). Směs je vhodná pro fixaci tkání, do nichž špatně pronikají jiné fixační tekutiny (výrobky s obsahem tuku).
Obsah : absolutní alkohol, chloroform, kyselina octová ledová

Příklad postupu pro přípravu parafínových řezů

(může se v různých laboratořích v některých detailech lišit) :

Vzorky je vhodné umístit do speciálních kazet, které umožňují průnik tekutiny, spolu s číslem vzorku.

Postup zahrnuje:

Zalévací média

 Zalévací média dělíme do dvou skupin podle rozpustnosti ve vodě :
- ve vodě rozpustná (želatina),
- ve vodě nerozpustná (parafín, celoidin).
Parafín je nejčastěji používané médium. Bod tání parafínu je mezi 56 - 58 °C. Pro histologické účely se zkvalitňuje přidáním 5% včelího vosku (vláčnost, soudržnost). Protože je parafín nerozpustný ve vodě, je celý proces zalévání poměrně dlouhý, musí zahrnovat odvodnění vzorku (vzestupná alkoholová řada - 60, 80, 90, 96 a 100%), prosycení látkou, která rozpouští parafín a je mísitelná s alkoholem (např. xylen, metylsalicylát) - zde dochází k projasnění vzorku. Vzorky se pak postupně prosycují parafínem ve 3 lázních při teplotě 62°C, aby se odstranil xylen. Větší část tohoto postupu je možno provést automaticky v přístroji – autotechnikon. Prosycený vzorek se pak zalévá v zalévacích komůrkách (2) parafínem a po zchladnutí získáme tkáňový bloček (2) připravený ke krájení. Používají se hotová zalévací média komerčně vyráběná.
Želatina se používá u vzorků, které mají drobivou konzistenci. Zalévání je jednoduché, vzorek se nemusí odvodňovat. Postupně se vkládají do lázní želatiny 10% a 20% (teplota 37 °C), vždy na 2 hodiny a pak se zalévají rozehřátým roztokem 20% želatiny v zalévacích komůrkách. Chladí se a nechá ztvrdnout ve formolu. Bločky se upraví a krájí na zmrazovacím mikrotomu.
Celoidin je vhodný pro zalévání velmi tvrdých tkání.

Krájení bločků

 Tkáně zalité ve vhodném médiu se krájejí zpravidla na mikrotomech sáňkových a rotačních, zatímco zmrazené bloky krájíme na mikrotomech zmrazovacích (kryostat). Základní součásti všech uvedených typů mikrotomů jsou podobné. Jsou to : podstavec, nůž, zařízení na upevnění bloku a zařízení na posun bloku proti noži (sáňkový) nebo naopak (rotační). V kryostatu (2) je možné dosáhnout teploty -20 až -60°C. Tloušťka řezů se řídí účelem, kterému mají řezy sloužit. Pro studijní účely jsou vhodnější tenčí řezy, v našich preparátech jsou řezy o tloušťce asi 4 mm.
Sériové řezy (použijeme všechny ukrojené řezy tak, jak jdou za sebou) - zhotovují se pro získání představy o trojrozměrném uspořádání některých struktur v preparátu. Nejlépe se série krájí z parafínových bloků na rotačním mikrotomu.
V našem případě jde o namátkově vybrané řezy - je žádoucí, aby vyšetřené řezy naopak nebyly stejné, ale umožňovaly posouzení různých částí vzorku, tak aby byla zajištěna objektivita výsledků vyšetření zejména při zjišťování složení výrobků.
Parafínové řezy, pořízené na rotačním a sáňkovém mikrotomu, se napínají na vodní hladině a přenášejí na podložní skla, která jsou opatřena jemným nátěrem směsi glycerinu s bílkem, příp. s želatinou. Podložní skla se suší na ploténce vyhřáté na 40 °C a pak v termostatu, teprve potom se barví. Méně často se zpracovávají jako volné řezy – použijí se silné řezy, barví se volně v barvícím roztoku a pak se teprve zachytávají na podložní sklo – to je těžké, často se řezy poškodí.
Řezy ze zmrazeného materiálu (z kryostatu) se umístí přímo na sklo.

Barvení preparátů – přehledné a cílené barvící postupy

Cílem barvení je získat přehled o všech strukturách v preparátu (přehledné barvení) nebo některé odlišit jejich zvýrazněním (cílené barvení). Histologické řezy se barví speciálními barvivy, která se vyznačují afinitou k různým složkám tkání.
Zmrazené řezy se barví přímo, parafínové řezy je nutné odparafínovat. Parafín se v řezech rozpouští rozpouštědlem (xylen) a sestupnou etanolovou řadou se řezy převedou do vody. Histologická barviva jsou převážně rozpustná ve vodě, vyjímečně v alkoholu. Barví se ručně ve speciálních kyvetách (2), nebo v barvícím automatu. Barviva se aplikují postupně nebo se smíchají do jednoho roztoku.
Přehledná barvení – správná diagnostika je založena na znalosti barevných odlišností a na znalosti morfologie : Cílená (speciální) barvení - jedna nebo více struktur jsou zvýrazněny a ostatní se barví slabě nebo vůbec :
na kolagen-Massonův trichrom zelený a modrý
trichrom podle Goldnera v modifikaci Charváta
dle Callejy
na elastin-orcein
na retikulin-Gömöri
na tuk-sudan III, olejová červeň
na plísně-Grocott
na kosti-Kossa
van Gieson (modifikace)
na polysacharidy-PAS
a další.

Základní přehledné barvení

 Hematoxylin - eozin je nejpoužívanější barvení, nepřímé, sukcedánní, basické. Vlastní barvící látkou je hematein (oxidační produkt hematoxylinu), důležité je spojení hemateinu s Al z kamence draselného (tzv. mořidlo). Tak vzniká potřebný barevný lak, je to silně pozitivně nabité jádrové barvivo. Podle druhu mořidla pak jsou různé druhy hematoxylinu (kamencový Mayerův, železitý Weigertův apod.). Eozin je kyselé xantenové barvivo, cytoplasmatické barvivo, eozinem se obarví všechno, jádra se pak diferencují vodou modře. Jedná se o skupinu barviv - nejčastěji se používá erytrosin a žlutý eosin.

Uzavírání obarvených řezů

 Dobře nabarvený preparát se uzavírá mezi podložní a krycí sklo do vhodného média. Obvykle jsou to látky nerozpustné ve vodě, a proto je nutno řezy provést alkoholovou řadou (odvodnit) a převést do rozpouštědla - xylenu. V praxi se dříve běžně používal kanadský balzám V naší laboratoři, ale i jinde, se dnes používají syntetická média různých značek (Solakryl, Eukitt).
V určitých případech se používá montování do glycerinové želatiny - např. při barvení na tuk, protože řezy nesmí přijít do styku s organickými rozpouštědly.
Postup při montování :
kapka média (2) se umístí na okraji řezu, krycí sklíčko se přiloží v úhlu 45° a opatrně se spouští (důležité je, aby nezůstaly vzduchové bubliny). Preparát se nechá zaschnout a potom se opatrně očistí (2) (3) okraje.

Vyšetření preparátů a hodnocení výsledků

Obarvené řezy jsou vyšetřovány ve světelném mikroskopu při menším zvětšení (např. 40x), pro studium detailů je používáno zvětšení 100x případně 200x. Obvykle se jedná o kvalitativní vyšetření. Popisuje se přítomnost jednotlivých druhů tkání ve vyšetřovaných vzorcích. Je možné se zaměřit jen na průkaz vybraných druhů tkání zvýrazněných speciálním barvicím postupem. Při identifikaci tkání živočišného a rostlinného původu je nutné vycházet z údajů v literatuře, pro srovnávání používat vzorky, připravené v  laboratoři a dále také schématické obrázky a fotodokumentaci ze starší literatury. Kvantitativním vyšetřením pak rozumíme počítání a měření objektů s cílem vyjádřit jejich poměrné zastoupení.

Dokumentace

O každém vyšetřovaném vzorku je veden laboratorní protokol s těmito údaji - datum odběru, druh výrobku, výrobce, složení (pokud bylo známé), postup zpracování (fixace, barvení), výsledek vyšetření. Aby nedošlo k záměně vzorků, je třeba označit nádobku názvem vzorku a číslem, pod kterým je vzorek veden v laboratorním protokolu, příp. i datem odběru, a dále i druh použité fixační tekutiny. Všechny zhotovené preparáty jsou po určitou dobu uchovány, u řady z nich je zhotovena fotodokumentace.