Cvičení č. 10

Téma :

Vyšetření preparátů a hodnocení výsledků.

Cíle cvičení :

  1. Princip vyšetření preparátů
  2. Kvalitativní mikroskopické vyšetření
  3. Kvantitativní mikroskopické vyšetření

1. Princip vyšetření preparátů

         Obarvené řezy se vyšetřují ve světelném mikroskopu při menším zvětšení (40x), pro studium detailů se použije zvětšení 100x, případně větší. Tkáně živočišného a rostlinného původu identifikujeme podle jejich charakteristických morfologických znaků (potřebné jsou tedy znalosti v oboru veterinární histologie a botanické mikroskopie) s přihlédnutím ke změnám, které utrpí při technologickém opracování, a dále podle barvitelnosti. Pro srovnávání je vhodné použít preparáty standardních a modelových vzorků

2. Kvalitativní mikroskopické vyšetření

         Vyšetřuje se obvykle 6 řezů při menším zvětšení se získá přehled, z jakých tkáňových součástí je vzorek složen. Pokud není možné, především podezřelé částice, spolehlivě identifikovat, použijeme větší počet řezů, větší zvětšení a další druhy barvení. Popisuje se přítomnost jednotlivých druhů tkání ve vyšetřovaných vzorcích. Jednotlivé druhy tkání, identifikované v histologických preparátech, jsou zaznamenávány s uvedením, ze kterých orgánů a častí těla pocházejí (pokud je to jistě možné).  

Hodnocení přítomnosti jednotlivých součástí jako:

3. Kvantitativní mikroskopické vyšetření

         Lze hodnotit poměr přítomných druhů součástí nebo jejich velikost. Obvykle se provádí při určování podílu svaloviny a rozmělněné tkáně ve výrobcích (šunka, šunkové výrobky) nebo podílu vazivové tkáně (kolagenní, elastické). Může však být zaměřeno i na jiné tkáně - kostní, chrupavkové a málo hodnotné doprovodné tkáně - hladká svalovina, lymfatická, žlázová a nervová tkáň. Je možné provést orientační kvantitativní hodnocení podílu zjištěných tkání. Pro přesnější kvantitativní hodnocení se provádí statistické vyhodnocení výsledků, které se získají počítáním a měřením součástí ve vzorku. Výsledky lze rovněž vyjádřit v procentuálním zastoupení. Obecně platí, že spolehlivost tohoto stanovení stoupá s počtem odebraných vzorků a prohlížených řezů.

1. Orientační kvantitativní hodnocení podílu zjištěných tkání - označením:
– převládající ve značném množství
– střední množství
– mírně
– nepatrně (minimálně jedna částice na každém řezu)
– ojediněle

2. Přesné vyjádřeni výsledků:

a)

 Na zkoumaných řezech se spočítá množství kousků vyšetřované tkáně nebo orgánu, přitom se přihlíží ke zvětšení a celkové ploše zkoumaného řezu
– 6 vzorků pro fixaci a z každého vzorku 5 řezů pro barvení (10. až 15, řez), celkem se tedy vyšetří 30 řezů.
– integrační okulár (obsahuje v kruhu určitý počet bodů, např. 25). Počítá se zde počet „zásahů", tzn. počet bodů, které se kryjí s některou tkání. Prohlédne se 25 zorných polí a stanoví se počet bodů pro jednotlivé tkáně a jejich poměr k celkovému počtu všech bodů (tj. 625). Při vyšetření se požívá čtyřicetinásobného zvětšení.
– zařízení zvané Point counter, kde se počítá asi s 6000 body. K rozlišení jednotlivých tkání je vhodné použít diferenciační barveni. Většinou se vyšetřuje 10 řezů.
– Počítání mikroskopických objektů. Není-li v zorném poli počítaných prvků mnoho, lze je počítat po celé jeho ploše. Při větším počtu se však snadno dopouštíme chyby. Abychom se tomu vyhnuli, používáme jako doplněk k mikroskopu tzv. počítací okuláry se čtvercovou clonou, kterou je možné zorné pole zmenšit nebo zvětšit. V každém případě však musíme pomocí objektivního mikrometru vypočítat vyhodnocovanou plochu celého zorného pole nebo čtverce. Použití programu pro obrazovou analýzu pro měření a počítaní objektů - umožňuje detailní srovnávání různých vzorků, přesné zpracování informací a různé způsoby vyjádření získaných výsledků. Je to metoda extrakce kvantitativních informací z obrazu získaného v digitální podobě přímo z mikroskopu s použitím kamery nebo fotoaparátu jako vstupní jednotky. Lze zpracovat i klasické fotografické materiály po převedení do digitální podoby. Zjištěné údaje se vyhodnocují pomocí statistických metod.

b)

 bodovací způsob:
– 6 rezů a na každém se určí množství hledaných složek počtem bodů, celkový možný počet bodů v jednom zorném poli je 10 (pokud jde o velké kousky tkáně, stačí 5). Z jednotlivých bodových hodnocení se stanoví průměry a ty se pak vyjádří procentuelně.

c)

 procentuální vyhodnocení:
– určí se jakou plochu zaujímá daná tkáň na řezu ve vztahu k celkové ploše řezu (v procentech)
3. Měření mikroskopických objektů - k lineárnímu měření mikroskopických struktur jsou k mikroskopu potřebné dva doplňky - okulárový mikrometr a objektivní mikrometr.
– okulárový mikrometr (měřící okulár) - skleněný kotouček s měřítkem o celkové délce 1 cm děleným na 100 dílků nebo délce 0,5 a děleným na 50 dílků. Sklíčko je umístněno v okuláru tak, že vidíme současně měřítko a obraz předmětu. Naměřené dílky však mají jen relativní hodnotu, tzn. že je můžeme použít pro stanovení poměrů délek a šířek. K vypočtení skutečné délky je nutné pro každé použité zvětšení stanovit jeho délku v mikrometrech. K tomuto převodu používáme objektivní mikrometr.
– objektivní mikrometr - broušená skleněná destička o velikosti podložního skla, na níž je vyryto nebo naneseno měřítko v celkové délce nejčastěji 1 mm, dělené na 100 dílků, tzn. 1 dílek odpovídá 10 um. Pro každé zvětšení je třeba stanovit měřítko zvlášť.