Biologie a genetika
pro bakaláře

Mikroskopická technika

POTŘEBY K MIKROSKOPOVÁNÍ
Laboratorní sklo: podložní skla (76 × 26 × 1-1,2 mm se zabroušenými okraji nebo bez zábrusu), krycí skla (čtvercového nebo obdélníkového tvaru 18 × 18, 22 × 22, 30 × 40 mm), kádinky, zkumavky, Petriho misky, střičky, odměrné válce, nálevky
Nástroje: kahan, nůžky, skalpel, pinzeta, bakteriologická klička, preparační jehla, kapátko
Přístroje: mikroskop, lupa, vodní lázeň
Chemikálie: kyseliny, hydroxidy a jejich soli, barviva, imerzní olej

PŘÍPRAVA MIKROSKOPU K MIKROSKOPOVÁNÍ znamená umístění mikroskopu tak, aby nosič tubusu byl od pozorovatele odvrácen a volná strana mikroskopického stolku směřovala k němu. Mikroskop musí být snadno v dosahu, aby pozorovatel mohl pohodlně sedět. Nejlépe je psát záznamy vpravo od mikroskopu a vlevo si umístit potřeby pro přípravu preparátů (leváci naopak). Mikroskop se spouští spínačem umístěným v podstavci mikroskopu. Pokud přerušujete mikroskopování pouze na čas, mikroskop nevypínejte (opakovaným zapínáním se zkracuje životnost žárovky). Preparát se vkládá do rohu upínacího zařízení stolku a poté se uchytí svorkou. Při mikroskopování se postupuje od nejméně zvětšujících objektivů po nejvíce zvětšující, tj. 4×, 10×, 40× a 100×.
Při zvětšení 40× a vyšším je vhodné korigovat optické vady očí, protože většina lidí nemá obě oční čočky stejně dioptricky silné. Nejdříve je třeba upravit rozestup okulárů (oční rozestup) a poté se snažit pozorovat obraz oběma očima. Pozorování jen jedním okem vyvolává jeho neúměrnou zátěž a při opakovaném zatěžování zhoršuje vady oka. Rozdíl vede opět k neúměrnému zatěžování jednoho oka. Vadu je možné kompenzovat úpravou dioptrické síly levého okuláru takto: zavřete levé oko a obraz dokonale zaostřete mikrošroubem při pozorování pravým okem v pravém okuláru, zakryjte si pravé oko a pozorujte obraz levým okem v levém okuláru. Pokud není obraz dokonale ostrý, zaostřete objekt pomocí točítka dioptrické korekce na levém okuláru. Poté byste měli oběma očima vidět stejně ostře. Vyhledáním optimální vzdáleností očí od okulárů docílíte při troše cviku splynutí obrazu z obou okulárů a obě oči tak budete zatěžovat rovnoměrně.

ZASTAVENÍ OBJEKTU V ZORNÉM POLI MIKROSKOPU znamená umístění objektu do středu zorného pole a zaostření a osvětlení obrazu objektu v zorném poli. Preparát se pokládá na stolek mikroskopu pod pérovou svorku tak, aby objekt nebo krycí sklo byly umístěny nad otvorem stolku směrem k objektivu (podložním sklem dolů a krycím nahoru). Při zastavování objektu v mikroskopu je třeba se dívat do mikroskopu a současně pomocí křížového vodiče pohybovat preparátem na stolku mikroskopu a pomocí makroposuvu najít správnou volnou pracovní vzdálenost. Jakmile se v mikroskopu objeví objekt, provede se doostření pomocí mikroposuvu. Je třeba si také seřídit osvětlení mikroskopu pomocí regulátoru osvětlení (v podstavci mikroskopu) a zvýšit hloubku ostrosti pomocí irisové clony kondenzoru. Při pozorování málo kontrastních objektů (epitelie, objektivový mikrometr, pylová zrna) je potřeba více zaclonit a zaostřit na správnou optickou rovinu. Při pozorování preparátů je potřeba dát si pozor na tzv. artefakty (termín poprvé použil Sir Julian Huxley), jako jsou např. škrábance, kazy ve skle, bubliny, prach, útvary z želatiny apod., které bývají zaměňovány za pozorované objekty.

Nejčastější chyby (závady) a jejich odstraňování:

Do velkých zásahů a oprav mikroskopu se nepouštějte, výjimkou jsou některé technické závady, které můžete sami odstranit:

Fáze a zásady mikroskopování:

1. Umístění mikroskopu před sebe, tak aby byl snadno v dosahu, a aby pozorovatel pohodlně seděl (mikroskopem během mikroskopování nepohybovat - při velkých zvětšeních se objekt může ztratit). Kontrola kompletnosti mikroskopu a zapnutí mikroskopu.
2. Prohlédnutí preparátu nejdříve pouhým okem ke zjištění polohy, velikosti nebo obarvení objektu (na některých preparátech je fixem v kroužku vyznačeno, kde je třeba objekt hledat). Hledat v obarvené části preparátu.
3. Umístění preparátu na stolek pod pérovou svorku (krycím sklem nahoru) a umístění objektu (pokud je viditelný pouhým okem) do dráhy světelného paprsku (ověřit z dálky při otevřené irisové cloně).
4. Seřízení rozestupu okulárů a kontrola nastavení dioptrického doostřování.
5. Levá ruka ovládá makrošroub a mikrošroub k vyhledání správné optické roviny a zaostření, pravá ruka ovládá křížový posun k vyhledávání objektů. K systematickému prohlížení preparátu slouží meandrovitý způsob.
6. Pozorování objektu nejdříve pod málo zvětšujícími objektivy (4× a 10×), středně zvětšujícími objektivy (40×) a nakonec pod imerzním objektivem (100×). Objektivy 40× a 100× nejsou na vyhledávání objektu, ale na detailní prohlédnutí objektu nalezeného při menších zvětšeních. Při použití objektivů 4× a 10× ostřit makrošroubem, při použití objektivů 40× a 100× ostřit mikrošroubem.
7. Při každém zvětšení je potřeba upravit množství procházejícího světla pomocí regulátoru napětí v podstavci mikroskopu a zvýšením hloubky ostrosti pomocí irisové clony. Při malém zvětšení co nejvíce zaclonit (uzavřít irisovou clonu) a přitom přidat světlo na zdroji (ne přidušené oranžové). Při větších zvětšeních je třeba postupně přidávat osvětlení otvíráním irisové clony.
8. Před každým použitím více zvětšujícího objektivu je třeba objekt umístit do středu zorného pole (tzv. středění objektu).
9. Záznam o pozorování (protokol – kresba, popis, závěr).
10. Před vytáhnutím preparátu z mikroskopu je dobré vrátit se k nejméně zvětšujícímu objektivu - preparát se díky většímu prostoru bezpečněji vyndá. Očištění preparátu a objektivu od imerze alkoholem, vypnutí mikroskopu a jeho přikrytí igelitovým krytem.

MĚŘENÍ VÝŠKY (TLOUŠŤKY) OBJEKTU se provádí pomocí mikrometrického měřítka vyrytého na objímce mikroposuvu. Obvod tohoto šroubu je rozdělen na 50 dílků po 2,5 µm. Při měření se postupuje tak, že se zaznamená hodnota dílku na měřítku při zaostření detailu objektu v horní optické rovině a poté se odečte hodnota dílku na měřítku při zaostření detailu objektu v dolní optické rovině. Počet dílků (rozdíl mezi odečtenými hodnotami) násobený 2,5 µm představuje skutečnou výšku (tloušťku) objektu v µm.

ÚKOLY - mikroskopická technika (viz úkoly)

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.