Molekulární biologie

Southern blotting a hybridizace

Princip

Southern blotting (Southernův přenos) je přenos jednořetězcové DNA (získané po denaturaci v NaOH) z gelu na nylonovou membránu v přístroji „vacuum blotter“ pod vakuem.

Hybridizace je založena na specifickém spojení (hybridizaci, renaturaci) komplementárních nukleotidových sekvencí pocházejících z různých molekul NK.

K hybridizaci se využívá sonda (krátký úsek DNA o známé nukleotidové sekvenci), která je značena fluorescenčně nebo radioaktivně. Sonda se váže na testovanou DNA v místě specifické sekvence a to na principu komplementarity.

Nejčastěji bývá hybridizace prováděna na nosičích (viz Southernův přenos), ale je například možno hybridizovat NK i v intaktních buňkách (hybridizace „in situ“).

Existuje také northernový (týká se RNA) a westernový (týká se proteinů) přenos (pojmenováno z legrace podle světových stran).

Obr.: Princip hybridizace testované DNA se specifickou značenou sondou (ss – jednořetězcová, ds - dvouřetězcová).

Průběh

Southern blotting + hybridizace:

1. Příprava a značení sondy - denaturace DNA na jednořetězcovou a značení sondy fluorescenčně nebo radioaktivně
2. RFLP a gelová elektroforéza - rozdělení restrikčních fragmentů testované DNA daného vzorku gelovou elektroforézou (viz předchozí metody)
3. Southern blotting
   • denaturace testované DNA v gelu (lázeň v NaOH) a přenos jednořetězcové DNA z gelu na nylonovou membránu v přístroji vacuum blotter
4. Hybridizace
   • inkubace membrány (s navázanou jednořetězcovou DNA) se značenou jednořetězcovou sondou a navázání sondy na DNA na principu komplementarity
   • odmytí nenavázané sondy
   • detekce sondy navázané na DNA na principu fluorescence (pokud byla sonda značena fluorescenčně) nebo autoradiografie (pokud byla sonda značena radioaktivně)

Obr.: Southern blotting a hybridizace

Využití

viz RFLP

Tyto výukové materiály byly spolufinancovány Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem ČR.