Staphylococcus aureus

Základní charakteristika

Staphylococcus aureus je nejvýznamnějším druhem rodu Staphylococcus (čeleď Staphylococcaceae). Je to fakultativně anaerobní, nepohyblivý, grampozitivní kok. Buňky mají velikost 0,7 – 0,9 µm a nejčastěji vytváří hroznovité shluky. S. aureus produkuje zlatožlutý pigment, na krevním agaru může způsobovat úplnou hemolýzu. Je kataláza pozitivní, zkvašuje manitol.

Bakterie rodu Staphylococcus lze podle schopnosti produkce enzymu plazmakoagulázy rozdělit na koaguláza pozitivní a koaguláza negativní druhy. Nejvýznamnějším zástupcem koaguláza pozitivních stafylokoků se schopností koagulovat králičí plasmu je S. aureus, dále je do této skupiny řazen S. intermedius a některé kmeny S. hyicus.

Faktory virulence

Virulence S. aureus je postavena na základě schopnosti produkce velkého množství biologicky aktivních látek, které se dělí do tří skupin: adhezivní faktory, propagační a transportní faktory a ochranné faktory a toxiny.

K adhezivním faktorům patří plazmakoaguláza (volná koaguláza) a clumping (shlukovací) faktor, jež způsobují polymeraci rozpustného fibrinogenu na fibrin, a dále několik produktů polysacharidové podstaty obvykle označovaných jako sliz, které umožňují bakteriím vázat se na vhodný povrch a hrají významnou roli při tvorbě biofilmů.

Do skupiny propagačních a transportních faktorů se řadí hemolyziny. Typické kmeny S. aureus produkují α-hemolyzin projevující se úplnou hemolýzou beranních erytrocytů v krevním agaru po 18hodinové inkubaci při 37 °C.

Ochranné faktory a toxiny jsou toxické exoproteiny, které chrání stafylokoky před obrannými mechanismy člověka (např. Panton-Valentinův leukocidin) nebo jsou původci toxikóz – exfoliativní toxiny (ETs), toxin syndromu toxického šoku (TSST-1) a stafylokokové enterotoxiny (SEs). Stafylokokové enterotoxiny (SEs) jsou zodpovědné za vyvolání alimentárního onemocnění. SEs vznikají v potravině jako metabolické produkty při množení S. aureus. Jejich značení SEA – SEU koresponduje s označením genů sea - seu. Schopnost produkovat SEs je prokázána u 50 – 60 % kmenů S. aureus. Je známo 20 typů SEs – pět tzv. klasických stafylokokových enterotoxinů SEA, SEB, SEC (SEC1, SEC2, SEC3), SED, SEE je nejčastěji zodpovědných za vznik alimentární intoxikace.

Další významné vlastnosti

Celosvětovým problémem se stal výskyt kmenů S. aureus rezistentních k oxacilinu (methicillin-rezistentní S. aureus = MRSA, antibiotiku používaného především při léčbě nozokomiálních infekcí.

Bakterie S. aureus mají schopnost během růstu tvořit exopolysacharidy – slizy. Pomocí adhesinu se mohou vázat na vhodný povrch a následným pomnožením vytvořit mnohovrstevný biofilm. Biofilmy představují závažný problém jak ve zdravotnictví, tak v potravinářském průmyslu. Rizikem je především vysoká odolnost biofilmů k antimikrobiálním látkám, čistícím a desinfekčním prostředkům a možnost přenosu genů rezistence mezi buňkami biofilmu.

Patogeneze

S. aureus přirozeně osidluje kůži a oblast nosohltanu lidí a zvířat. Při oslabení imunitního systému hostitele je schopen vyvolat různá onemocnění – kožní záněty, alimentární onemocnění, pneumonie, osteomyelitidy, syndrom toxického šoku, syndrom opařené kůže, abscesy, bakteriální endokarditidy a sepse.

Za vznik jednoho z nejčastějších onemocnění z potravin typu alimentární intoxikace – stafylokokové enterotoxikózy jsou zodpovědné stafylokokové enterotoxiny (SEs). Z dvaceti typů SEs je nejčastěji zodpovědných za otravu z potravin pět tzv. klasických stafylokokových enterotoxinů: SEA – SEE. Stafylokoková enterotoxikóza se projevuje nevolností, zvracením, bolestmi břicha, průjmem (bez horečky) a bolestmi hlavy. Příznaky onemocnění se objevují za 1-6 hodin po konzumaci potravin v důsledku stimulace zakončení nervus vagus v oblasti žaludku a odezní zpravidla za 24 hodin. Infekční dávka S. aureus pro zdravého jedince je minimálně 10⁵ KTJ.g^-1 a koncentrace toxinu v potravině 1 ng.g^-1.

Epidemiologický význam

Z důvodu rychlého průběhu stafylokokové enterotoxikózy a podobnosti tohoto onemocnění s jinými alimentárními intoxikacemi, je mnoho případů stafylokokové enterotoxikózy nezaznamenáno. Výskyt hlášených alimentárních intoxikací v České republice je ve srovnání s alimentárními toxoinfekcemi, které se pohybují v desetitisících hlášených případů ročně, zanedbatelný (např. v roce 2010 bylo dle databáze Epidat SZÚ hlášeno 100 případů bakteriálních intoxikací). Všeobecně se však předpokládá, že jsou hlášeny pouze případy v epidemické souvislosti a sporadické případy, vzhledem k rychlému nástupu a odeznění klinických příznaků hlášeny nejsou.

Prevence spočívá především v zabránění růstu S. aureus v potravinách působením chladírenských teplot a použitím technologií eliminujících jejich výskyt v potravinách (např. pasterace). Sekundární kontaminaci potravinářských výrobků s vyšším podílem ruční práce je možno zabránit důsledným dodržováním osobní hygieny pracovníků, mytím rukou a používáním ochranných rukavic.

Výskyt v surovinách a potravinách

S. aureus je komenzálem teplokrevných živočichů a člověka. Vyskytuje se na sliznicích respiračního ústrojí, především v nosní a ústní dutině, na pokožce, v intestinálním a urogenitálním traktu. Je také součástí běžné mikroflóry vemene. Hlavním zdrojem kontaminace syrového mléka jsou klinické a subklinické stafylokokové mastitidy.

Potraviny mohou být kontaminovány druhem S. aureus pocházejícím ze zvířat, prostředí nebo lidí v průběhu výrobního procesu především pracovními nástroji a pracovníky potravinářských provozů. Nejčastěji bývají stafylokoky kontaminovány mléčné výrobky, lahůdky, pudinky a salátové dresinky, dále pak maso, šunky, ryby a mořské plody. Největší riziko kontaminace je u potravin s vysokým podílem ruční práce. S. aureus se pomnožuje v potravinách ponechaných delší dobu při pokojové teplotě. Rizikové množství S. aureus v potravině, které je schopno vyprodukovat dostatečné množství SEs (alespoň 1 ng. g^-1 potraviny), je 10⁵ KTJ.g^-1.

Vliv vnějších a vnitřních faktorů a technologických procesů

S. aureus se množí při teplotách 7 – 48 °C (optimum je 30 – 37 °C), pasterační teploty nepřežívá, mražení nemá příliš významný vliv na životaschopnost a počty bakterií v potravině. Většina kmenů může růst v rozmezí pH 4,0 – 10,0 (optimum je 7,0 – 7,5). Je relativně odolný sušení. Minimální hodnota aktivity vody pro jeho množení je 0,86. S. aureus je tolerantní k vyššímu obsahu NaCl v prostředí (10 – 15 %). Jeho růst omezuje přítomnost jiné mikroflóry, proto se dobře množí např. v tepelně opracovaných výrobcích.

Limity pro tvorbu SEs nejsou identické jako limity pro množení S. aureus. Obecně jsou SEs v potravině produkovány při teplotách 10 - 46 °C, pH 4,5 – 9,6 a minimální vodní aktivitě 0,87. Díky svému složení a struktuře jsou SEs velice stabilní a odolné vůči působení proteolytických enzymů pepsinu, trypsinu, chymotrypsinu, reninu a papainu. Jsou také termostabilní a k jejich inaktivaci zpravidla dochází při 100 °C až za 30 minut.

Metody stanovení v potravinách

Pro stanovení S. aureus v potravinách se používají živná média obsahující selektivní složky inhibující růst doprovodných mikroorganismů, např. 5,5 – 10 % NaCl, azid sodný, teluričitan draselný, chlorid lithný či některá antibiotika – polymyxin, neomycin. Diagnostickou složkou je většinou vaječný žloutek, příp. fibrinogen a králičí plazma.

Podle ČSN EN ISO 6888-1 (1999) je pro izolaci koaguláza pozitivních stafylokoků užíván Baird-Parker agar (B-P), kde S. aureus vytváří charakteristické černé kolonie (redukce teluričitanu), které jsou obklopeny zónou projasnění, která je výsledkem působení lecitinázy na suplement žloutkovou emulzi.

ČSN EN ISO 6888-2 (1999) doporučuje pro vyšetření potravin, kde se předpokládá kontaminace stafylokoky vytvářejícími na B-P agaru atypické kolonie či průvodní mikroflórou, která může znesnadnit odečet kolonií použití agarové půda s králičí plazmou a fibrinogenem (RPF agar). Koaguláza pozitivní stafylokoky na této půdě vytvářejí černé, šedé nebo dokonce bílé malé kolonie obklopené zónou precipitace, která indikuje koagulázovou aktivitu.

K detekci přítomnosti klasických SEs (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) v potravinách jsou běžně používány imunologické metody: reverzní pasivní latexová aglutinace (detekuje konkrétní typ SEA – SED), ELISA metoda (detekuje SEA – SEE jako sumu nebo lze i detekovat konkrétní typ) a metoda ELFA (detekuje SEA – SEE pouze jako sumu, které jsou dostupné formou komerčně vyráběných imunologických testů.

Metody využívané při konfirmaci, identifikaci a typizaci

Spolu s typickou morfologií a pigmentací kolonií se posuzuje tvorba hemolýzy na krevním agaru.

Přítomnost extracelulárního enzymu - volné koagulázy se prokazuje reakcí s fibrinogenem králičí plazmy, která se projeví tvorbou chuchvalců, sraženin či úplným ztuhnutím plazmy ve zkumavce.

Další typickou reakcí pro S. aureus je průkaz přítomnosti vázané koagulázy (clumping faktoru). Jde o povrchový protein, který reaguje s fibrinogenem králičí plazmy a mění jej na fibrin, což se projevuje shlukováním buněk stafylokoků a tvorbou okem viditelných vloček na podložním sklíčku. Clumping faktor lze také prokázat užitím komerčně dostupných latexaglutinačních souprav (např. Dryspot Staphytest Plus).

Za použití molekulárně-biologických metod (např. PCR s využitím specifických primerů lze nejen detekovat a identifikovat druh S. aureus, ale i prokazovat přítomnost genů kódujících tvorbu stafylokokových enterotoxinů a dalších faktorů virulence a také genů kódujících rezistenci k antimikrobiálním látkám (např. MRSA kmeny).